盐酸曲唑酮是1种5-羟色胺重摄取抑制剂，属于苯基哌嗪类化合物^[1]，作为1种非典型四环类抗抑郁药，具有中枢镇静作用，提高睡眠质量的功效^[2]。盐酸曲唑酮杂质主要包括杂质A杂质、B杂质、C杂质、D杂质、杂质E及杂质F（结构式见图 1）。目前国内药典未收载盐酸曲唑酮有关物质项，美国药典（USP 40）和英国药典（BP 2018）均采用高效液相色谱法作为盐酸曲唑酮杂质的检测方法。化学对照品的定值通常采用质量平衡法，该方法从总含量中扣除水分、残留溶剂、灰分等的含量来确定标准物质的最终含量^[3-4]。质量平衡法是1种间接的纯度测定方法，结果准确度影响因素有很多，例如色谱主峰与杂质峰的分离程度，色谱峰的响应因子等。见十年来，随着核磁共振定量（qNMR）技术的发展，其在药品标准制定、标准物质定值、药品质量控制等领域的应用日益广泛^[5]。与传统定量方法相比，qNMR技术具有以下明显的特点：核磁共振信号强度直接与参与共振的原子核数目成正比^[6]，理论上只需结构和含量已知的化合物作为参考，不需要提供样品自身标准物质^[7]；对样品没有破坏性，操作较为简单，分析速度快等^[8]。本文通过选择合适的内标物与氘代溶剂，探索合适的qNMR参数，建立盐酸曲唑酮杂质对照品的定量方法，并对方法进行考察，最后与质量平衡法结果进行比较。研究结果表明，该方法快速、准确、可信，为盐酸曲唑酮的质量控制及其杂质对照品的定值提供了新的方法。

1 仪器与试药

Ascend-500型核磁共振波谱仪（Bruker公司）；MSA 6.6S百万分之一电子天平（Sartoriuts公司）。

氘代二甲基亚砜（DMSO-d₆）（Sigma-Aldrich，纯度99.9%，批号13I-163）；氘代丙酮（acetone-d₆）（Sigma-Aldrich，含量99.9%，批号MKCD3426）；对照品对苯二甲酸二甲酯（DMT，含量99.9%，批号510052-201401）、盐酸曲唑酮杂质A（含量93.1%，批号510145-201701）、盐酸曲唑酮杂质B（含量99.7%，批号510146-201701）、盐酸曲唑酮杂质C（含量99.4%，批号510147-201701）、盐酸曲唑酮杂质D（含量99.6%，批号510148-201701)、盐酸曲唑酮杂质F（含量99.5%，批号510150-201701），中国食品药品检定研究院；对苯二酚（ACROS，99.5%，批号A0275012）。

2 方法 2.1 供试品溶液制备

精密称取盐酸曲唑酮杂质A、B、C、D和F各约10 mg，分别加入DMT约6 mg及氘代试剂约0.5 mL（盐酸曲唑酮杂质A和F以DMSO-d₆为溶剂，其余杂质以acetone-d₆为溶剂），超声（150 W，80 kHz）使其完全溶解，混合后使用涡旋仪溶解，所得溶液转移至5 mm核磁管中备用。

2.2 核磁仪器参数设置

采用90°脉冲，脉冲程序为noesyig1d，谱宽设置为10 000 MHz，采样次数32次，采样时间设置为3.28 s，采样点数为64 K，接收器增益设置为32；盐酸曲唑酮杂质A和F的驰豫延迟时间（D1）设置为20 s，盐酸曲唑酮杂质B、C和D的D1设置为30 s。

2.3 数据处理与qNMR计算

将采集得到的氢谱进行傅里叶变换，然后对谱图进行基线校正和相位校正。对选定的内标定量峰和样品定量峰进行积分，每个峰5次，取积分面积的平均值，计算公式如下：

$ P_{\mathrm{X}}=\frac{A_{\mathrm{x}} \times N_{\mathrm{std}} \times M_{\mathrm{X}} \times m_{\mathrm{std}}}{A_{\mathrm{std}} \times N_{\mathrm{x}} \times M_{\mathrm{std}} \times m} \times P_{\mathrm{std}} $

式中，P_x为供试品含量；A_x为供试品定量峰积分面积；N_x为供试品定量峰包含质子数；M_x为供试品相对分子质量；m为供试品称样量；A_std为内标物峰积分面积；N_std为内标物定量峰包含质子数；M_std为内标物相对分子质量；m_std为内标物称样量，P_std为内标物含量。

3 结果与讨论 3.1 溶剂与内标物的选择

本研究将DMSO-d₆与acetone-d₆作为考察溶剂，内标物分别考察对苯二酚与DMT。核磁定量所用溶剂对样品和内标物要有好的溶解性。其中，盐酸曲唑酮杂质A和F在acetone-d₆中难溶，在DMSO-d₆中易溶，因此选择DMSO-d₆作为溶剂。其余杂质对照品在acetone-d₆中易溶，在DMSO-d₆中微溶，所以选择acetone-d₆作为溶剂。内标物定量峰要求与样品定量峰有良好的分离。对苯二酚定量峰与样品峰在δ 6.5左右有部分重合，DMT定量峰与杂质样品峰分离良好，因此选择DMT作为内标物。

3.2 定量峰的选择

一般要求内标物定量峰与样品定量峰有良好的分离，并优先选择偶合裂分较少的相邻质子峰^[9]。内标物DMT选择δ 8.09/8.13处苯环质子峰作为定量峰，盐酸曲唑酮杂质A、B、C、D和F分别选择δ 7.85、δ 7.76、δ 7.76、δ 7.76和δ 7.27处的苯环单质子峰。见图 2。

3.3 参数的设置

影响核磁定量准确度的参数主要有D1和扫描次数^[10]，D1主要影响积分强度，扫描次数主要影响信噪比^[11]。通常要求D1大于质子纵向弛豫时间（T1）的5倍^[12]，使质子在激发前有足够的时间恢复到平衡态，确保相应峰有足够的强度。采用反转恢复技术，测量内标物和样品相应峰在各自溶剂中的T1^[13]。待测样品定量峰和内标DMT定量峰T1为1.599~5.561 s。具体值见表 1。因此，将盐酸曲唑酮杂质A和F的D1设置为20 s，盐酸曲唑酮杂质B、C和D的D1设置为30 s。通过测量内标物，盐酸曲唑酮杂质B、C、D和DMT在DMSO-d₆和acetone-d₆中的T1，发现溶剂对质子T1有一定的影响。在acetone-d₆中DMT苯环质子的T1约为在DMSO-d₆中的2倍，因此，在建立核磁定量方法，选择氘代溶剂的过程中，不仅要考虑溶解性和稳定性，而且要注意溶剂对质子T1的影响。通常扫描次数与峰信噪比的平方根成正比，增加扫描次数以获得足够高的信噪比^[14]；但扫描次数增加会延长实验时间。本实验选择扫描次数为32，在保证一定信噪比的前提下，减少实验时间。

3.4 核磁定量方法线性考察

分别配制盐酸曲唑酮杂质A、B、C、D和F样品测试浓度50%~200%范围内的6份系列溶液，进行测定。以样品/内标称样量比值为横坐标，样品定量峰/内标定量峰面积比值测得量为纵坐标左图，进行线性回归，得到5个线性方程。见表 2。

3.5 重复性试验

分别称取盐酸曲唑酮杂质对照品约10 mg，DMT约6 mg。每种杂质对照品各6份，在相同核磁参数条件下连续进样。对每份样品所得图谱积分5次，将积分平均值带入公式计算，结果见表 3。重复性结果良好。

3.6 稳定性试验

分别取各杂质对照品的同一份供试品溶液，在室温下放置0、3、6、9、12 h，分别进行测定，计算各杂质对照品的含量，考察溶液稳定性。结果见表 4。表明供试品溶液在12 h内稳定。

3.7 qNMR法与质量平衡法比较

根据质量平衡法，盐酸曲唑酮杂质对照品含量（%）=（100%-水分含量-残留溶剂含量-炽灼残渣含量）×HPLC含量。将盐酸曲唑酮杂质对照品分别按照高效液相方法测得HPLC纯度，采用库仑滴定仪对水分进行测定，采用气相色谱法测得残留溶剂含量，同时对炽灼残渣含量进行考察。得到的质量平衡法纯度与qNMR法结果基本一致。如表 5所示。

4 结论

本文建立了盐酸曲唑酮杂质A、B、C、D和F的qNMR方法，并对该方法的线性和稳定性进行了考察。该方法准确度高，同时具有操作简单、快捷等优点，可作为质量平衡法定值的有益补充。