2019, Vol. 39 
高血压是一种以动脉血压增高为临床表征的高发性心血管疾病，是引起慢性肾病、冠心病和脑中风等疾病的最危险因素。常见的化学降压药按作用机制可分为[1]：①利尿剂，如吲达帕胺等；②β受体阻滞剂，如洛尔类；③α受体阻滞剂，如唑嗪类；④血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB），如沙坦类；⑤血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI），如普利类；⑥钙拮抗药（CCB），如地平类。这些化学降压药见效快，但长期服用会产生肝肾损害等副作用，因此，患者往往青睐于毒副作用小的中成药和保健食品，不法分子利用这种心理，在其中非法添加化学药，宣称降压快速而牟取暴利，却造成患者重复过量使用化学降压药，使血压发生骤降或剧烈波动，易导致肾损伤和诱发中风等[2]。
目前，中成药及保健食品中添加问题比较突出[3]，而针对降压类中成药及保健食品中非法添加药物检测的国家标准《药品检验补充方法和检验项目批准件》仅涉及硝苯地平等13种成分（批件号2009032和2014008），且分离方法零散，效率低下。文献报道方法主要有TLC法[4]、HPLC法[5-6]、GC-MS法[7]、LC-MS/MS法[8-9]，其中LC-MS/MS是多数文献报道的高通量分析方法，但由于仪器昂贵、维护成本高，方法普及受限[10]。近年来，随着色谱技术的发展，Kirkland等[11-12]将0.5 μm厚的多孔硅壳熔融到1.7 μm实心硅核上，制备出核壳型（fused-core）亚3 μm填料颗粒，具有极小的传质阻抗和轴向扩散，允许使用更短的色谱柱和较高的流速，以达到快速、高分辨率的分离[13]，产生的反压仅仅为UPLC亚2 μm填料色谱柱的一半，使得在常规低压液相色谱仪上就能够实现UPLC快速分离[14]。本实验选择上述六大类34种常用化学降压药为目标物，采用亚3 μm填料核壳色谱柱，建立高通量的二极管阵列高效液相色谱快速分析方法，大大缩短检测时间，为新形势下药品和保健食品的质量监管提供了强有力的技术保障。
1 仪器与试药岛津LC-20AD高效液相色谱仪（SPD-M20A二极管阵列检测器和LCSolution工作站）；密理博Milli-Q Integral 5超纯水器；赛多利斯PB-21酸度计；梅特勒XS205DU十万分之一分析天平；宁波新芝SB-5200D超声波清洗器。
对照品卡托普利（批号100318-201103）、酒石酸美托洛尔（批号100084-201403）、盐酸地巴唑（批号100420-201002）、盐酸艾司洛尔（批号100749-200501）、盐酸塞利洛尔（批号100807-200501）、盐酸阿呋唑嗪（批号100728-200501）、富马酸比索洛尔（批号100711-201602）、盐酸哌唑嗪（批号100164-201204）、盐酸普萘洛尔（批号100783-201202）、盐酸特拉唑嗪（批号100375-201103）、吲达帕胺（批号100257-201605）、咪达普利（批号100748-200401）、盐酸贝凡洛尔（批号101033-200901）、盐酸地尔硫䓬（批号100161-201404）、盐酸维拉帕米（批号100223-200102）、盐酸尼卡地平（批号100586-201102）、雷米普利（批号101378- 201501）、利血平（批号100041-201213）、盐酸贝尼地平（批号101049-201001）、苯磺酸氨氯地平（批号100374-201605）、硝苯地平（批号100338-201404）、奥美沙坦酯（批号100864-201503）、氯沙坦钾（批号100597-201102）、厄贝沙坦（批号100607-201603）、盐酸贝那普利（批号100768-201403）、螺内酯（批号100193-201203）、盐酸喹那普利（批号100568-201302）、缬沙坦（批号100651- 201604）、尼莫地平（批号100270-201403）、非洛地平（批号100717-201403）、西尼地平（批号100993-200701）、拉西地平（批号100741-200802）和坎地沙坦酯（批号100685-201602）均购自中国食品药品检定研究院，卡维地洛（批号LRAA9063）购自Sigma-Alorich公司。94批样品主要来源为2015年~2017年国家保健食品安全风险监测抽样和市县食药监局联合公安部门打四非专项行动抽样，部分通过互联网以及微商购买。甲醇（Merck公司）、甲酸（Tedia公司）为色谱纯，其余试剂均为国产分析纯，水由密理博公司超纯水器制得。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱：Shiseido Capcell Core C18（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流动相：A为0.02 mol·L-1乙酸铵（用甲酸调节pH=3.0±0.1），B为甲醇，梯度洗脱（0~9 min，70%A；9~20 min，70%A→52%A；20~25 min，52%A；25~32 min，52%A→22%A；32~45 min，22%A→10%A），流速：0.7 mL·min-1；检测波长：215 nm和230 nm；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。在上述色谱条件下，34种化学降压药分离良好，典型色谱图见图 1。
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图 1 34种化学降压药混合对照品HPLC色谱图（峰号同表 1） Fig.1 HPLC chromatograms of 34 mixed reference substances of chemical hypotensors (peak numbers are the same as those in Tab. 1) |
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表 1 34种化学降压药的线性方程、线性范围、相关系数、检测下限、定量下限和精密度 Tab.1 The linear equations, linear ranges, correlation coefficients, LOD, LOQ and precisions for 34 kinds of chemical hypotensors |
精密称取对照品硝苯地平、奥美沙坦酯、盐酸塞利洛尔、盐酸普萘洛尔、咪达普利、盐酸贝凡洛尔、盐酸维拉帕米、雷米普利、盐酸贝尼地平、氯沙坦钾、螺内酯各约50 mg，分别置25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得质量浓度约为2 000 μg·mL-1的单一成分对照品溶液；称取对照品盐酸阿呋唑嗪、盐酸特拉唑嗪、吲达帕胺、盐酸地尔硫䓬、盐酸尼卡地平、利血平、坎地沙坦酯各约25 mg，分别置25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得质量浓度约为1 000 μg·mL-1的单一成分对照品溶液；称取对照品盐酸哌唑嗪、卡维地洛、苯磺酸氨氯地平、厄贝沙坦、缬沙坦、拉西地平、尼莫地平、非洛地平、西尼地平各约25 mg，分别置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得质量浓度约为500 μg·mL-1的单一对照品溶液。取上述单一成分对照品溶液各2 mL，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液（1）；称取卡托普利、酒石酸美托洛尔、盐酸艾司洛尔、盐酸贝那普利、盐酸喹那普利的对照品各约20 mg，富马酸比索洛尔对照品约10 mg和盐酸地巴唑对照品约5 mg，置50 mL棕色量瓶中，用混合对照品储备液（1）溶解并定容至刻度，即得混合对照品储备液（2）。各单一成分对照品溶液和混合对照品储备液均2~4 ℃避光冷藏备用。
2.2.2 供试品溶液取样品（颗粒剂或片剂需研细，混匀；硬胶囊需取内容物混匀，囊壳剪碎备用；软胶囊需挤出内容物混匀，囊壳剪碎备用），准确称取或者量取一定量（口服液精密量取10 mL；硬胶囊和软胶囊称取1次服用剂量的内容物，加1次服用剂量的囊壳；其他制剂称取1次服用剂量），置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇适量超声提取（功率200 W，频率40 kHz）20 min，冷却至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤，取续滤液待测。如果检测后判定为非法添加的阳性样品，其浓度超出线性范围，则在此基础上继续稀释。
2.3 标准曲线和线性范围精密量取“2.2.1”项下混合对照品储备液（2）适量，用甲醇依次定量稀释50、25、10、5、2.5和1倍，制成系列浓度的混合对照品溶液S1~S6（按浓度由低到高顺序编号），按“2.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积值Y对质量浓度X（ng·mL-1）进行线性回归，各化合物的线性范围、回归方程和相关系数见表 1。结果表明34种化学药在各自质量浓度范围内与峰面积均呈良好线性关系，r均大于0.998。
2.4 检测下限和定量下限试验精密量取“2.2.1”项下混合对照品储备液（2）适量，用甲醇定量稀释，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以3倍信噪比计算检测下限（LOD），以10倍信噪比计算定量下限（LOQ），结果见表 1。
2.5 进样精密度试验取“2.3”项下S4混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，连续测定6次，计算上述34种化学降压药的峰面积RSD，结果在0.2%~2.5%（表 1），表明方法的进样精密度良好。
2.6 加样回收率与重复性试验选择阳性检出率较高的胶囊制剂作为回收率试验基质，精密称取胶囊内容物0.2 g，置10 mL量瓶中，精密加入S4混合对照品溶液1 mL，作为低浓度回收率组；精密加入S6混合对照品溶液1 mL，作为中浓度回收率组；精密加入S6混合对照品溶液5 mL，作为高浓度回收率组。每个浓度水平配制6份，按“2.2.2”项下方法进行样品处理后进样测定，加样回收率和重复性RSD（n=6）结果见表 2。从表 2可见，34种化学降压药低中高浓度的平均回收率均在82.7%~118.9%，结果较为满意，低中高浓度峰面积RSD控制在0.5%~4.1%，表明方法重复性较好。
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表 2 34种化学降压药平均回收率及重复性（n=6） Tab.2 Average recoveries and repeatability(n=6)for 34 kinds of chemical hypotensors |
取“2.3”项下S4混合对照品溶液10 μL，分别在配制后避光冷藏放置0、4、8、12、16、20、24 h，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算，34种化学降压药峰面积的RSD在0.40%~3.3%（n=6）之间，表明34种化学降压药溶液至少在24 h内稳定。
2.8 样品测定94批降压类中成药及保健食品照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，通过比较样品与对照品的保留时间以及扫描光谱，判定样品中是否含有非法添加的药物。结果有16批样品检出卡托普利等11种成分，阳性率为17.0%，检出含量见表 3。其中卡维地洛为首次报道检出；吲达帕胺、硝苯地平、氨氯地平、卡托普利和利血平是非法添加最多的5种化学药，且存在混合添加情况。16批阳性样品中，有5批存在不同降压机制化学药的联合添加，如以钙拮抗药+血管紧张素转换酶抑制剂和利尿剂+β受体阻滞剂等形式，尚未发现同一作用机制化学降压药的混合添加。通过混合添加追求快速降压效果的非法添加行为，给患者带来极其严重的安全风险。
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表 3 阳性样品中非法添加成分种类及其含量（mg·g-1） Tab.3 Types and contents of detected components in positive samples |
34种化学降压药极性差异较大，采用常规的5 μm硅胶颗粒填料的色谱柱难以在短时间内对多种成分进行快速分离。在相同的流动相体系下，试验分别采用Shiseido Capcell Core C18 （150 mm×4.6 mm，2.7 μm）和Agilent Zorbax SB C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色谱柱对34种化学降压药的混合对照品溶液进行分析（见图 1和图 2）。由图可知，选用分析性能优秀的Agilent Zorbax SB C18作为常规5 μm填料色谱柱的代表，流速1.0 mL·min-1，通过调整流动相，大部分成分在160 min内可以得到分离，但盐酸地尔硫䓬和卡维地洛，奥美沙坦酯和氯沙坦钾，厄贝沙坦、盐酸贝那普利和螺内酯色谱峰重叠严重，无法基线分离；亚3 μm填料核壳色谱柱Shiseido Capcell Core C18在流速0.7 mL·min-1条件下，可在45 min内将34种化学降压药完全分离，分离度大于1.8，相比Agilent Zorbax SB C18色谱柱，节省约72%的分析时间和约80%的溶剂。
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图 2 34种化学降压药混合对照品在常规5 μm填料色谱柱上的色谱图（峰号同表 1） Fig.2 HPLC chromatograms of 34 mixed reference substances of chemical hypotensors on conventional 5 μm particles column(peak numbers are the same as those in table 1) |
本试验采用的亚3 μm填料核壳色谱柱，其Fused-core独特核壳结构，显著改善了色谱峰形及分离度，实现对34种化学降压药的高分辨率快速分离，具有近似UPLC上使用的亚2 μm色谱柱的超高柱效，分析时的反压仅21.5 MPa，远低于亚2 μm色谱柱的40 MPa反压，使我们在常规低压液相色谱仪上也能实现对复杂混合物的快速分离。此外，亚3 μm填料核壳色谱柱所用2 μm入口筛板孔径要远大于亚2 μm色谱柱（0.5 μm），避免筛板孔径过小发生堵塞[15]，增加色谱柱耐用性。
3.2 波长选择扫描光谱响应值主要由物质性质和浓度共同决定。扫描光谱经归一化[0, 1]处理消除浓度因素后，可以更加直观地反映不同物质区别，图 3是34种降压类化学药经归一化处理后的扫描光谱图。
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图 3 地平类（A）、洛尔类（B）、普利类（C）、沙坦类（D）、唑嗪类（E）和其他类（F）扫描光谱图 Fig.3 Spectrums of the dipine(A), lol(B), pril(C), sartan(D), zosin(E)and else(F) |
从图 3可知，大部分降压类化学药在200~215 nm波长附近有最强吸收，但是大部分溶剂和含氧酸根C=O成分在此处具有普遍的强吸收，基质干扰大。地平类（苯磺酸氨氯地平、非洛地平、拉西地平、尼莫地平、西尼地平、硝苯地平、盐酸尼卡地平和盐酸贝尼地平）在230 nm和350 nm波长处有较强吸收（图 3-A）；洛尔类（富马酸比索洛尔、盐酸贝凡洛尔、盐酸普萘洛尔、盐酸塞利洛尔）在230 nm和270 nm波长处吸收较强（图 3-B）；普利类（雷米普利、咪达普利、盐酸贝那普利和盐酸喹那普利）在230 nm存在较强吸收（图 3-C）；沙坦类（奥美沙坦酯、厄贝沙坦、坎地沙坦酯、氯沙坦钾和缬沙坦）在230 nm和250 nm波长吸收较强（图 3-D）；唑嗪类（盐酸阿呋唑嗪、盐酸哌唑嗪和盐酸特拉唑嗪）在250 nm和340 nm波长吸收较强（图 3-E）；杂类（卡维地洛、利血平、螺内酯、盐酸地尔硫䓬、盐酸维拉帕米和吲达帕胺）扫描光谱相对复杂多样，但是在230 nm波长处具有比230~350 nm波长处强的吸收（图 3-F）。根据上述各成分的紫外光谱吸收特征，除卡托普利、盐酸地巴唑、酒石酸美托洛尔和盐酸艾司洛尔选择215 nm波长外，其余30种降压药选择230 nm作为检测波长外，分析简化，灵敏度也能满足实验需求。
3.3 流动相选择本文对流动相进行了优化。由于待分析的化合物种类较多，极性差别较大，梯度洗脱更有利于分离。有机相比较了甲醇和乙腈，相同梯度条件下使用甲醇作有机相，目标化合物能获得更好的分离效果，乙腈-水相系统唑嗪类出现拖尾峰，分离效果较差；水相比较了0.1%甲酸、0.1%磷酸、0.1 mol·L-1磷酸二氢钾和0.02 mol·L-1乙酸铵（用甲酸调节pH），采用0.1%甲酸和0.02 mol·L-1乙酸铵（用甲酸调节pH）分析效果较好，但0.1%甲酸体系卡托普利色谱峰形较差，而0.02 mol·L-1乙酸铵（用甲酸调节pH）体系卡托普利色谱峰响应得到显著改善。研究还发现，流动相的pH对化合物分离影响较大，考察了0.02 mol·L-1乙酸铵（甲酸调节pH为2.0~5.0）对34种降压药物的分析效果，结果显示，pH=3.0±0.1时各成分能实现较好的分离，故本文采用0.02 mol·L-1乙酸铵（用甲酸调节pH=3.0±0.1）-甲醇梯度洗脱流动相体系，同时乙酸铵属于挥发性缓冲盐，便于后续研究实现液相色谱到液相色谱-质谱方法的转变。
3.4 小结本文利用亚3 μm填料核壳色谱柱，在常规低压液相色谱仪上实现降压类中成药及保健食品中化学降压药的高通量快速筛选，检测效率高，成本低，适用范围广，灵敏度高，为基层食药监部门快速发现和有效打击此类非法添加行为提供技术支撑。
| [1] |
陈新谦, 金有豫, 汤光. 新编药物学[M]. 第17版. 北京: 人民卫生出版社, 2011. CHEN XQ, JIN YY, TANG G. The New Materia Medica[M]. 17th Ed. Beijing: People's Medical Publishing House, 2011. |
| [2] |
董永成, 杜士明, 陈永顺, 等. 中成药及保健品非法添加化学成分的类型、危害及对策[J]. 时珍国医国药, 2006, 17(8): 1601. DONG YC, DU SM, CHEN YS, et al. Types and harm of illegally added chemicals in traditional Chinese medicine and health food as well as countermeasure against the phenomenon[J]. Lishizhen Med Mat Med Res, 2006, 17(8): 1601. DOI:10.3969/j.issn.1008-0805.2006.08.166 |
| [3] |
徐硕, 金鹏飞, 徐巧玲, 等. 中药及保健品中非法添加化学药物的研究进展[J]. 中国新药杂志, 2015, 24(16): 1843. XU S, JING PF, XU QL, et al. Advances in the chemical substances illegally adulterated in traditional Chinese medicines and health foods[J]. Chin J New Drugs, 2015, 24(16): 1843. |
| [4] |
王铁松, 仝禹, 郑洁, 等. 薄层色谱法快速筛查降脂、降压、止咳平喘类中药制剂中的29种添加化学药物[J]. 中国药学杂志, 2010, 45(11): 857. WANG TS, TONG Y, ZHENG J, et al. Detection of 29 adulterations in lipid-regulating, antihypertensive, antitussive and antiasthmatic herbal remedies by TLC[J]. Chin Pharm J, 2010, 45(11): 857. |
| [5] |
陈惠玲, 封令霞. HPLC检测中药中非法添加化学降压药物[J]. 中国现代应用药学, 2011, 28(5): 1346. CHEN HL, FENG LX. Detection of antihypertensive agents illegally added in traditional Chinese medicine by HPLC[J]. Chin J Mod Appl Pharm, 2011, 28(5): 1346. |
| [6] |
胡青, 张甦, 王柯, 等. 中药及保健食品中违禁添加7种降压类化学药物的HPLC-DAD法测定[J]. 中国医药工业杂志, 2010, 41(8): 601. HU Q, ZHANG S, WANG K, et al. Determination of seven anti-hypertension chemical drugs added illegally into traditional Chinese medicines and health food by HPLC-DAD[J]. Chin J Pharm, 2010, 41(8): 601. DOI:10.3969/j.issn.1001-8255.2010.08.014 |
| [7] |
李涛, 朱小红, 林芳. GC-MS联用方法检测降压类中成药及保健食品中非法添加的化学药物[J]. 药物分析杂志, 2010, 30(11): 2212. LI T, ZHU XH, LIN F. GC-MS determination of chemical drugs added illegally in Chinese patent medicine and health food[J]. Chin J Pharm Anal, 2010, 30(11): 2212. |
| [8] |
欧贝丽, 张红伟, 徐宏祥. UPLC-MS/MS法测定中成药及保健品中添加的36种化学药物[J]. 药物分析杂志, 2013, 33(12): 2141. OU BL, ZHANG HW, XU HX. UPLC-MS/MS determination of 36 chemicals added into traditional Chinese medicines and health care products[J]. Chin J Pharm Anal, 2013, 33(12): 2141. |
| [9] |
王琤帅, 舒展, 朱洁, 等. 中成药和保健食品中18种非法添加降压药物的HPLC-QTOF/MS定性检测[J]. 中国药师, 2016, 19(6): 1084. WANG ZS, SHU Z, ZHU J, et al. Detection of 18 antihypertensive agents illegally added in traditional Chinese medicines and healthy care products by HPLC-QTOF/MS[J]. China Pharm, 2016, 19(6): 1084. DOI:10.3969/j.issn.1008-049X.2016.06.016 |
| [10] |
BORGES EM, ROSTAGNO M, MEIRELES MA. Sub 2μm fully porous and partially porous (core-shell)stationary phases for reversed phase liquid chromatography[J]. RSC Adv, 2014, 4(44): 22875. DOI:10.1039/C3RA45418E |
| [11] |
KIRKLAND JJ, TRUSZKOWSKI FA, RICKER RD. A typical silica-based column packings for high-performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr A, 2002, 965(1-2): 25. DOI:10.1016/S0021-9673(01)01339-5 |
| [12] |
GRITTI F, GUIOCHON G. Unusual behavior of the height equivalent to a theoretical plate of a new poroshell stationary phase at high temperatures[J]. J Chromatogr A, 2007, 1169(1): 125. |
| [13] |
GONZALEZ RV, OLIVES AI, MARTIN MA. Core-shell particles lead the way to renewing high-performance liquid chromatography[J]. Trac-Trend Anal Chem, 2015, 64: 17. DOI:10.1016/j.trac.2014.08.008 |
| [14] |
KIRKLAND JJ, SCHUSTER SA, JOHNSON WL, et al. Fused-core particle technology in high performance liquid chromatography:an overview[J]. J Pharm Anal, 2013, 3(5): 303. DOI:10.1016/j.jpha.2013.02.005 |
| [15] |
MCCALLEY DV. Instrumental considerations for the effective operation of short, highly efficient fused-core columns.Investigation of performance at high flow rates and elevated temperatures[J]. J Chromatogr A, 2010, 1217(27): 4561. DOI:10.1016/j.chroma.2010.04.070 |