普瑞巴林（pregabalin）是一种γ-氨基丁酸（GABA）受体激动剂，临床常用于治疗带状疱疹神经痛、纤维肌痛综合征等神经病理性疼痛，以及成年患者局部不全性癫痫发作，广泛性焦虑症等疾病^[1-2]。由于普瑞巴林口服溶液本身不具有充分的抗菌效力，且为多剂量包装，为防止其在正常贮藏和多次使用过程中由于微生物污染和繁殖，使药物变质而对使用者造成危害，通常都会加入一定量的抑菌剂以保证药品的质量及安全性^[3]。

口服液体制剂常用抑菌剂为对羟基苯甲酸酯类及苯甲酸类等。对羟基苯甲酸酯类的抑菌机制主要是与病原微生物酶系统结合，影响或阻断其新陈代谢过程^[4-5]。为了提高抑菌剂的杀菌和抑菌能力，往往利用抑菌剂之间的协同作用，采用复配抑菌剂扩大杀菌和抑菌谱范围^{[4, 6]}。普瑞巴林口服溶液中添加的抑菌剂为对羟基苯甲酸甲酯（羟苯甲酯）和对羟基苯甲酸丙酯（羟苯丙酯），两者合用通过协同作用有效提高抑菌或杀菌能力。

抑菌效力作为微生物评价的重要指标，是保证制剂安全性、有效性的关键因素，企业在药品开发阶段必须确认药品中抑菌剂的抑菌效力。然而，所有抑菌剂都具有一定的毒性，为保证用药安全，《中国药典》2015年版明确规定，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量，成品制剂中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有害的浓度^[3]。但《中国药典》仅对抑菌效力检查方法进行了规定，对于抑菌剂种类和浓度如何筛选，未做详细规定。

为了探索普瑞巴林口服溶液中羟苯甲酯、羟苯丙酯的合理添加浓度，本课题通过对不同浓度的羟苯甲酯和羟苯丙酯进行配比组合，检测不同浓度抑菌剂的抑菌效力，力求在更低的浓度范围内寻找二者合理有效的配比浓度，为生产企业在药物研发阶段抑菌剂浓度筛选提供实验依据。

1 仪器与材料 1.1 仪器

ME2002E电子天平（上海Mettler Toledo公司）；HFsafe-1200生物安全柜（上海力康医疗设备有限公司）；MLS-3781高压蒸汽灭菌器（日本Panasonic公司）；IF450恒温培养箱（德国Memmert公司）；ICP450低温培养箱（德国Memmert公司）；SF450灭菌箱（德国Memmert公司）；HTY-601集菌仪（浙江泰林生物技术股份有限公司）。

1.2 菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]和黑曲霉[CMCC（F）98003]均由中国医学细菌保藏管理中心（CMCC）提供，用于菌液制备的工作菌株均为第3代。

1.3 样品

普瑞巴林口服溶液，规格为500 mL·瓶^-1，均由杭州和泽医药科技有限公司提供；1612054批（高浓度）：羟苯甲酯0.2%，羟苯丙酯0.03%；1612053批（中浓度）：羟苯甲酯0.13%，羟苯丙酯0.02%；1612052批（低浓度）：羟苯甲酯0.05%，羟苯丙酯0.01%。

1.4 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）（批号3303005）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）（批号20160901）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）（批号3302035）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）（批号3302126）均购自广东环凯微生物科技有限公司，培养基适用性检查结果均符合《中国药典》2015年版规定。以上培养基均按使用说明书配制。

2 方法 2.1 菌液制备

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]和黑曲霉[CMCC（F）98003]均按照《中国药典》2015年版四部通则1121“抑菌效力检查法”中提供的方法制成适宜浓度的菌液，备用。

2.2 方法适用性研究

选取抑菌剂含量较高的普瑞巴林口服溶液（1612054批：羟苯甲酯0.2%，羟苯丙酯0.03%），按照《中国药典》2015年版四部通则1105“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”进行，方法适用性试验试验菌的回收率均不得低于70%。

2.3 抑菌效力测定 2.3.1 供试品接种

取包装完整的含高、中、低3个抑菌剂浓度的普瑞巴林口服溶液各1批，每批各取5瓶，每瓶分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉中的一种试验菌，接种体积均为1 mL，接种后供试液含菌量每1 mL约为10⁵~10⁶ CFU，充分混匀，使供试品中的试验菌分布均匀，置25 ℃避光贮存。

2.3.2 存活菌数测定

根据产品类型，按照《中国药典》2015年版通则1121“抑菌效力检查法”表 2-3的规定，在各间隔时间点14、28 d分别取相应试管中的供试品1 mL，采用经方法适用性试验验证的计数方法进行存活菌数测定。测定细菌用胰酪大豆胨琼脂培养基，测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基。根据存活菌数测定结果，计算1 mL供试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值。

2.3.3 结果判断

口服制剂抑菌效力判断标准见下表 1，表中的“减少的lg值”是指各间隔时间测定的菌数lg值与1 mL供试品中接种的菌数lg值的相差值。表中“A”是指应达到的抑菌效力标准，特殊情况下，如抑菌剂可能增加不良反应的风险，则至少应达到“B”的抑菌效力标准。

3 结果 3.1 方法适用性试验结果

预试验中选取抑菌剂含量较高的普瑞巴林口服溶液原液（羟苯甲酯0.2%，羟苯丙酯0.03%），分别加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉，采用平皿法进行计数方法适用性试验，结果白色念珠菌和黑曲霉的回收率均达到70%以上，而金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌3株菌的回收率均小于70%，无法达到药典要求。后续采用薄膜过滤法进行上述3株细菌的计数方法适用性试验，结果各试验菌的回收率仍低于70%。根据《中国药典》2015年版通则1105规定，如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适用性试验。经试验验证，最终细菌选择经薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液的方法进行方法适用性试验，真菌选择平皿法进行计数方法适用性试验。

根据表 2方法适用性试验结果，方法适用性试验结果的回收率=（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数×100%，均不低于药典规定的70%。表明本品抑菌效力检查细菌计数方法可采用薄膜过滤法[取供试品原液1 mL，加至100 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，摇匀，薄膜过滤，每膜用上述缓冲液500 mL分次冲洗，依法检查（《中国药典》2015年版通则1105薄膜过滤法），应符合规定]；真菌计数方法可采用平皿法[取供试品原液，依法检查（《中国药典》2015年版通则1105平皿法]，应符合规定）。

3.2 抑菌效力测定结果

根据表 3抑菌效力测定结果，参照口服制剂抑菌效力判断标准，可见1612054批（羟苯甲酯0.2%、羟苯丙酯0.03%）和1612053批（羟苯甲酯0.13%、羟苯丙酯0.02%）对细菌和真菌的抑菌效力均能达到《中国药典》的抑菌效力判断标准。而1612052批（羟苯甲酯0.05%、羟苯丙酯0.01%）对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑制作用在间隔14 d分别减少了0.6 lg和0.1 lg，均达不到药典规定的至少降低3 lg的标准，对铜绿假单胞菌的抑制作用间隔时间28 d与14 d比较增加了0.2 lg。1612052批对白色念珠菌的抑制作用在间隔时间14 d增加了0.1 lg，达不到药典规定的至少降低1 lg的标准，间隔时间28 d与14 d比较增加了0.1 lg。故含羟苯甲酯0.05%，羟苯丙酯0.01%的1612052批普瑞巴林口服溶液抑菌效力达不到药典要求。

4 讨论

抑菌效力检查是对供试品中微生物存活情况的一个长期的、动态的监测过程。既要研究供试品受污染后短时间内抑菌剂对大量入侵微生物的抑制或杀灭情况，又要检测随时间推移微生物对周围环境产生耐受或抑菌剂稳定性发生改变后，供试品中微生物总量是否仍能被控制在合理的范围之内^[7]。抑菌效力检查实验过程中，需要在规定的间隔时间测定每份供试品中存活菌数，因此存活菌数测定方法的正确与否，直接关系到能否真实反映药品抑菌效力的强弱^[8]。对于非无菌产品微生物限度检查的计数方法适用性试验，建立的方法学常为1:10供试液的方法学，微生物计数时，检测下限为 < 10 CFU·g^-1（CFU·mL^-1）。而对于抑菌效力检查时，NI要求28 d与前1个时间点比较，试验菌增加的数量不超过0.5 lg，假如前一个测定时间点平均菌落数为1 CFU·g^-1（CFU·mL^-1），lg值则为0，若28d平均菌落数为9 CFU·g^-1（CFU·mL^-1），lg值则为0.95，两者差值为0.95，明显大于0.5 lg，不符合药典中不超过0.5 lg的要求。若采用1:10供试液检测的话，2个时间点报告的结果均为 < 10 CFU·g^-1（CFU·mL^-1），lg值均报告为 < 1，无法准确比较两者差值，因此笔者认为在进行计数方法适用性试验时，应采用原液进行试验，当菌落数 < 10 CFU·g^-1（CFU·mL^-1）时，应准确报告该检测点的菌落数。

对羟基苯甲酸酯类防腐剂是国际上公认的广谱、高效、低毒类防腐剂，已广泛应用于药品、食品、化妆品等领域，但该类防腐剂尽管低毒，使用量过大仍会严重危及人体健康^[9]，因此探索药物中抑菌剂的最低有效剂量仍然势在必行。有研究发现对羟基苯甲酸酯类防腐剂对革兰氏阳性菌、霉菌和酵母菌有较强抑制作用，对革兰氏阴性菌如铜绿假单胞菌抑制作用较弱^[10-11]。本研究中，1612052批（羟苯甲酯0.05%，羟苯丙酯0.01%）对铜绿假单胞菌的抑制作用很弱，在28 d时恢复生长，与文献报道一致。但1612052批对白色念珠菌的抑制作用也很弱，可能与普瑞巴林口服溶液中主药及其他辅料的影响有关。

本研究中含羟苯甲酯0.2%、羟苯丙酯0.03%和含羟苯甲酯0.13%、羟苯丙酯0.02%的普瑞巴林口服溶液对5株菌的抑菌效力均达到《中国药典》要求，而含羟苯甲酯0.05%、羟苯丙酯0.01%的普瑞巴林口服溶液对黑曲霉的抑菌效力达到药典要求，但对其余4株菌的抑菌效力均不符合药典规定。因此，羟苯甲酯0.13%、羟苯丙酯0.02%可作为普瑞巴林口服溶液抑菌剂的选择浓度，但若希望继续下探羟苯甲酯和羟苯丙酯的使用浓度，则应在羟苯甲酯0.05%~0.13%、羟苯丙酯0.01%~0.02%之间设置中间浓度，继续探索抑菌效力检查结果。

对于口服溶液抑菌效力的测定，美国药典和欧洲药典都有相关的方法与规定，《中国药典》2005年版对部分剂型使用的防腐剂做了规定，2010年版药典首次收载抑菌效力检查法指导原则，2015年版药典改为强制性标准抑菌效力检查法，可见我国对药品抑菌剂的要求越来越严格^[12]。抑菌剂的选用对药品制剂质量影响深远，应引起足够的重视。