2019, Vol. 39 
2. 北京中医药大学中药分析与转化中心, 北京 100029;
3. 北京中医药大学北京中医药研究院, 北京 100029;
4. 北京中医药大学生命科学学院, 北京 100029
2. Research Center for Chinese Medicine Analysis and Transformation, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
3. Beijing Research Institute of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
4. School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
中药天麻为兰科植物天麻Gastrodia elata Bl. 的干燥块茎，为传统名贵中药之一，主治小儿惊风、癫痫抽搐、头痛眩晕、肢体麻木等[1]。天麻中分离鉴定的化学成分主要有酚类、有机酸类、多糖类及甾体类[2-3]，文献报道其有效成分为天麻素、对羟基苯甲醇等酚类成分[4-5]。2015年版《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）一部以天麻素和对羟基苯甲醇为指标成分来评价天麻质量，天麻素和对羟基苯甲醇的总量不得低于0.25%[1]。已有相关研究证明天麻的有效成分为天麻素类化合物[6-7]，其中天麻素具有镇静作用[8]、治疗老年痴呆症[9]、神经保护作用[10]等。另有研究表明，天麻中除天麻素发挥药效外，还包含其他活性成分如巴利森苷类化合物[11]，其具有改善学习记忆、抗抑郁、抗衰老等药理活性作用[12]。有学者对这一类成分药代动力学进行了研究，发现巴利森苷在体内主要代谢为天麻素[13-14]。因此，如果仅以天麻素和对羟基苯甲醇作为评价指标，不能全面地评价其天麻的质量。
陈琛等[15]总结了天麻素的检测技术：高效液相色谱法、紫外分光光度法、近红外光谱法、高效毛细管电泳法、薄层色谱法和化学测定法，而天麻中的天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C，具有苯环（π*-π*）结构特征，有较强的荧光吸收。近几年文献尚未报道荧光检测技术在天麻药材中的定量分析。本研究建立了高灵敏度的荧光检测方法，对28批不同产地天麻中天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C5个成分（结构如图 1）同时进行了定量分析，可更准确地评价天麻药材。
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图 1 天麻中5个成分的结构式 Fig.1 The structures of five components in Gastrodia Rhizoma |
Agilent 1260高效液相色谱仪；G1321B荧光检测器（Agilent公司）；Milli-Q超纯水（Millipore公司）；KQ-500 E超声波清洗器（昆明市超声仪器有限公司）；METILER TOLEDO电子天平（十万分之一）。
1.2 试药天麻药材购买于河北安国药材市场和广州清平药材市场；对照品天麻素（批号T-007-161216，纯度 > 98%）和对羟基苯甲醇（批号D-059-160328，纯度 > 98%）购买于成都瑞芬思生物科技有限公司；对照品巴利森苷A（纯度 > 98%）、巴利森苷B（纯度 > 98%）和巴利森苷C（纯度 > 98%）委托中国科学院大连化学物理研究所制备；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；其他试剂为分析级。
2 方法与结果 2.1 色谱条件资生堂MGⅢ色谱柱NO. A15AD01147（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱（0~3 min，30%→40%B；3~8 min，40%→50%B；8~11 min，50%→100%B），柱温35 ℃，进样体积5 μL，流速1 mL·min-1。天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的理论塔板数不低于10 000，分离度均大于1.5，拖尾因子均小于2.0。色谱图见图 2。
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1.天麻素（gastrodin）2.对羟基苯甲醇（4-hydroxybenzyl alcohol）3.巴利森苷B（parishin B）4.巴利森苷C（parishin C）5.巴利森苷A（parishin A） 图 2 混合对照品（A）及天麻提取物（B）荧光色谱图 Fig.2 Chromatograms of the mixed reference substances(A)and the Gastrodia Rhizoma extract(B |
取对照品天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C适量，精密称定，加50%甲醇水溶解并定容，配制成天麻素和对羟基苯甲醇混合对照品的质量浓度为10 μg·mL-1的溶液，巴利森苷类3个混合对照品的质量浓度为100 μg·mL-1的溶液，4 ℃储存备用。
2.2.2 供试品溶液精密称取天麻粉末（过3号筛）约1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，称量，超声（功率120 W，频率40 kHz）提取30 min，放冷。再次称量，用稀乙醇补足减失的量。摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL，浓缩至近干。残渣加乙腈-水（3:97）混合溶液溶解，转移至100 mL量瓶中。用乙腈-水（3:97）混合溶液稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过。
2.3 方法学验证 2.3.1 线性范围分别精密量取配制好的混合对照品储备液，采用逐级稀释的方法，配制天麻素和对羟基苯甲醇混合浓度为10、25、250、500、1 000、2 000、5 000 ng·mL -1，巴利森苷混合浓度为250、2 500、5 000、10 000、20 000、50 000 ng·mL-1的溶液，即得不同浓度的混合对照品溶液。在上述色谱条件下进行分析，以峰面积Y对质量浓度X（ng·mL-1）绘制标准曲线，分别得到天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的回归方程：
Y=0.042 6X-0.175 4 r=0.999 6
Y=0.106 9X-2.332 4 r=0.999 9
Y=0.012 6X-1.925 2 r=0.999 6
Y=0.009 3X-4.017 2 r=0.999 9
Y=0.009 3X-2.143 6 r=0.999 7
天麻素、对羟基苯甲醇浓度在10~50 000 ng·mL-1范围内线性关系良好。巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C质量浓度在250~250 000 ng·mL-1范围内线性关系良好。
2.3.2 定量下限按10倍信噪比计算，天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的定量下限分别为3、3、10、10、10 ng·mL-1。
2.3.3 稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0、4、8、12、24 h进样5 μL，测定天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的峰面积，其RSD（n=7）分别为2.2%、0.49%、2.2%、1.3%、4.9%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.3.4 精密度试验取对照品溶液5 μL，连续进样7针，天麻素保留时间RSD为0.2%，峰面积RSD为0.56%；对羟基苯甲醇保留时间RSD为0.2%，峰面积RSD为0.4%；巴利森苷A保留时间RSD为0.19%，峰面积RSD为1.22%；巴利森苷B保留时间RSD为0.22%，峰面积RSD为0.89%；巴利森苷C保留时间RSD为0.21%，峰面积RSD为1.4%，精密度良好。
2.3.5 重复性试验取同一批次样品6份，按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定含量。样品中天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的平均含量（n=6）分别为1.57、2.54、4.00、1.44、1.95、7.63 mg·g-1，RSD分别为2.4%、1.1%、1.1%、1.8%、3.5%，表明该方法重复性良好。
2.3.6 加样回收率精密称取已知含量的河南天麻粉末0.5 g，分别精密加入混合对照品溶液1 mL，按照“2.2.2”项下方法，溶液制备供试品。按照“1.2”色谱条件进行含量测定，根据峰面积和回归方程计算5个成分的含量及回收率。由表 1可知，本方法的回收率较高。
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表 1 加样回收率试验结果（n=6） Tab.1 Results of recovery test |
精密称取不同产地28批天麻各1 g，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，以外标法计算天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的含量，结果见表 2和图 3。
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表 2 不同产地天麻中5个成分测量结果（mg·g-1） Tab.2 Results of content of five components in Gastrodia Rhizoma from different habitat |
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A.天麻素（gastrodin）B.对羟基苯甲醇（4-hydroxybenzyl alcohol）C.巴利森苷A（parishin A）D.巴利森苷B（parishin B）E.巴利森苷C（parishin C）F.总天麻素（total gastrodin） 图 3 28批天麻中5个成分含量 Fig.3 The content of five components in 28 batch of Gastrodia Rhizoma |
本研究对分离色谱条件进行了考察。课题组前期采用HPLC-DAD法测定5个成分，发现有较严重的基线漂移，低于1 μg·mL-1时有较高的基线噪音（如图 4），分析5个化合物结构有紫外末端吸收的特征，是造成基线漂移的原因。根据这5个成分具有苯环（π*-π*）结构特征，推测其有较强的荧光吸收，建立HPLC-FLD分析方法对天麻中的5个成分进行定量分析。首先，分别对天麻素、对羟基甲醇、巴利森苷类的激发波长和发射波长进行了摸索，确保这5个成分均能有较大吸收，最终确定激发波长为228 nm，发射波长为300 nm；其次，对拖尾现象进行了解决，比较了流动相乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水，发现加入0.1%甲酸添加剂有效改善峰拖尾现象；最后，对流动相的比例进行了摸索，在保证R≥1.5前提下，使分析时间在10 min内达到全部分离。相较紫外检测器，所建立的荧光检测器方法谱图杂质干扰少，分离度好，谱峰清楚，基线漂移小，灵敏度更高，各化合物的定量下限达到10 ng·mL-1可为进一步完善天麻药材的质量评价方法提供参考依据。
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A. HPLC-FLD B. HPLC-UV 图 4 混合对照品（1 μg·mL-1）色谱图 Fig.4 The chromatograms of mixed reference substances(1 μg·mL-1) |
本研究利用HPLC-FLD同时测定了28批不同产地天麻中5个成分的含量。由图 3可以看出，江西天麻中的天麻素含量最高，而巴利森苷类的含量较低；西藏黑天麻中的对羟基苯甲醇含量较高，而巴利森苷含量较低；甘肃天麻中巴利森苷类含量最高，同时其他2个成分含量适中。2015年版《中国药典》[1]明确规定，天麻中的天麻素和对羟基苯甲醇的含量不能低于0.25%。云南乌天麻、湖北红天麻、贵州红天麻、东北天麻以及安徽大天麻不符合2015年版《中国药典》规定，其余均符合要求。
3.3 质量分析本研究在天麻药材5个成分定量分析的基础上，对巴利森苷类化学成分进行了天麻素摩尔质量转换，计算出总天麻素的含量。从实验数据可以看出，巴利森苷类含量较高，大多数高于天麻素。相关文献报道[16]，天麻中以结合态存在的以柠檬酸和天麻素缩合而成的苄醇酯类成分，如巴利森苷C（一分子柠檬酸酯与二分子天麻素缩合），巴利森苷B（一分子柠檬酸酯与二分子天麻素缩合），巴利森苷A（一分子柠檬酸酯与三分子天麻素缩合）（如图 1）。用总天麻素公式（总天麻素=[（巴利森苷A质量/巴利森苷A摩尔质量）×3+（巴利森苷B质量/巴利森苷B摩尔质量）×2+（巴利森苷C质量/巴利森苷C摩尔质量）×2+天麻素摩尔数]×天麻素的摩尔质量）进行计算得知，江西、甘肃的总天麻素含量最高达到23.0 mg·g-1，湖北的总天麻素含量最低3.7 mg·g-1。从结果分析，总天麻素为游离天麻素的3~8倍。天麻素、对羟基苯甲醇以及总天麻素（天麻素和结合天麻素）为指标性成分更能够全面评价天麻药材的质量，所以有必要探索巴利森苷类的成分对天麻药效的贡献及其与天麻素之间的内在转换关系和转化率，并为进一步完善天麻的质量控制奠定基础。
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