2019, Vol. 39 
拉曼光谱是近些年迅猛发展的一种快速无损检测技术，在食药品安全检测领域有广泛的应用。食品[1]、药品[2-3]、保健食品[4-5]、化妆品[6]中非法添加各种功能化合物是不法分子牟取暴利的一种常见手段，屡禁不止，是食药监管部门风险监测、监督抽检的一项重要内容。近10年来，食药检验机构投入了大量人力、物力、财力进行技术创新，出台了许多具有针对性的补充检验方法，但是每种补充检验方法都是针对一到几种目标化合物的专属性方法，无法做到对可能添加化合物的全覆盖式筛查。本文利用国家重大科学仪器专项（便携式薄层色谱-拉曼光谱联用仪（2012YQ180132）及其药品快检支撑系统（www.traitdc.org）的研究成果，并对成果进行了较为全面的应用考察[7-13]，结合成果使用情况，对标示降糖功能中成药、保健食品中可能添加化合物全覆盖式筛查进行了研究，对6种阳性样品进行了模拟分析[14-15]，同时使用HPLC等技术对检测结果进行了验证[16-17]。
1 仪器与试药 1.1 仪器薄曼联用仪（国家重大科学仪器专项便携式薄层色谱-拉曼光谱联用仪及其药品快检支撑系统项目）；液质联用仪（1.Q Exactive超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；2.Agilent 1290-6490超高效液相质谱联用仪，安捷伦科技有限公司）；薄层板（Merck公司）。
1.2 试药 1.2.1 对照品甲苯磺丁脲（批号SZBA013XV，纯度99.6%）来自SIGMA-ALDRICH；盐酸二甲双胍（批号100664-200602，纯度100%，105℃干燥2 h后使用）、盐酸苯乙双胍（批号100922-201001，纯度99.7%）、格列本脲（批号100135-200404，纯度100%，105℃干燥3 h后使用）、格列齐特（批号100269-201004，纯度99.9%）、格列吡嗪（100281-200602，纯度99.4%，105℃干燥2 h后使用）、格列喹酮（批号100280-201002，纯度99.9%）、格列美脲（批号100674-200301，纯度100%）、瑞格列奈（批号100753-200501，纯度100%）、盐酸吡格列酮（批号100634-201202，纯度100%）、马来酸罗格列酮（批号100952-200701，纯度99.5%）、阿卡波糖（批号100808-200902，纯度97.4%），均来自中国食品药品检定研究院。
1.2.2 试剂甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）、氯仿、环己烷、乙酸乙酯、冰醋酸、硝酸银、柠檬酸三钠、盐酸、二甲基甲酰胺均为分析纯，国药集团化学试剂上海有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（K30，国药集团化学试剂上海有限公司）、聚乙烯吡咯烷酮（polyethylene pyrrolidone，PVP，分析纯，上海埃彼化学试剂有限公司）、水。
1.2.3 模拟阳性样品山药玉竹胶囊（YW201508497）、山药茯苓胶囊（YW201508515）、汉方糖肽胶囊（YW201507789）、苦瓜参芪胶囊（YW201507784）、知葛胶囊（YW201508706）、苦参降糖胶囊（YW201508707）。
2 方法与结果 2.1 溶液配制 2.1.1 对照品溶液取上述12种对照品各适量，精密称定，分别加甲醇溶解并定量稀释制成每1 mL中各约含1 mg的溶液，分别作为相应的对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液称取山药玉竹胶囊内容物0.52 g（相当于2粒）、山药茯苓胶囊的内容物0.44 g（相当于2粒）、汉方糖肽胶囊的内容物0.19 g（相当于1粒）、苦瓜参芪胶囊的内容物0.33 g（相当于1粒）、知葛胶囊的内容物0.28 g（相当于2粒）、苦参降糖胶囊的内容物0.38 g（相当于1粒），分别置10 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声（100 Hz，450 kW）处理30 min，放冷，甲醇稀释至刻度，摇匀，离心5 min（5 500 r·min-1），取上清液，即得样品溶液1~6。
2.1.3 水相银溶胶的制备称取90 g的硝酸银于500 mL去离子水中加热至沸腾，逐渐加入1%的柠檬酸三钠溶液10 mL，保持沸腾1 h，继续搅拌至溶液冷却，得到灰绿色的银溶液，冷藏保存。
2.1.4 二甲基甲酰胺（DMF）溶胶的制备在装有冷凝管的恒压漏斗中加入0.1 mol·L-1硝酸银溶液2 mL与溶解了0.3 g PVP的水溶液8 mL，用1 mmol·L-1盐酸将其pH调至8，逐滴加入到煮沸的DMF中，约10 min加完，反应20 min，反应后的溶液经减压蒸馏（0.8 MPa），除去水和其他溶剂，直至完全蒸干。残余在瓶底的附着了纳米银的PVP经干燥后重新溶解在去离子水中洗涤数次，在2 500~3 000 r·min-1的转速下离心分离30 min。取上清液，冷藏保存。
2.2 标准库建设 2.2.1 SERS标准谱库建设取上述对照品溶液各5 μL，使用薄曼联用仪自动点样、点胶，展开缸展开，采集SERS信号，最佳采集参数与特征峰位、峰强度见表 1。
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表 1 12个降糖化合物优化参数及特征峰位、峰强对照 Tab.1 Comparison of optimal parameters, peak position and peak strength of the 12 hypoglycemic compounds |
取上述对照品溶液，使用Q Exactive超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪，建立1级、2级质谱库，分别见图 1~2。
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1.盐酸二甲双胍（metformin hydrochloride）2.盐酸苯乙双胍（phenformin hydrochloride）3.甲苯磺丁脲（tolbutamide）4.格列齐特（gliclazide）5.格列吡嗪（glipizide）6.马来酸罗格列酮（rosiglitazone maleate）7.盐酸吡格列酮（pioglitazone hydrochloride）8.格列本脲（glibenclamide）9.格列美脲（gliquidone）10.格列喹酮（glimepiride）11.瑞格列奈（repaglinide） 图 1 11种对照品1级质谱图 Fig.1 Primary mass spectra of 11 kinds of reference substances |
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1~11.同图 1（same as |
取盐酸苯乙双胍、盐酸二甲双胍、马来酸罗格列酮、盐酸吡格列酮对照品溶液及样品1~6溶液各5 μL，使用薄曼联用仪自动点样，氯仿-甲醇-水（8:2:0.2）展开，紫外灯（365 nm）下成像后的薄层色谱图见图 3。
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1.盐酸苯乙双胍（phenformin hydrochloride）2.盐酸二甲双胍（metformin hydrochloride）3.马来酸罗格列酮（rosiglitazone maleate）4.盐酸吡格列酮（pioglitazone hydrochloride）5~10.样品1~6（sample 1-6） 图 3 薄层色谱图 Fig.3 Thin layer chromatograms |
取盐酸苯乙双胍、盐酸二甲双胍及样品1~6溶液各5 μL，使用薄曼联用仪自动点样，在展开剂乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸（5:6:0.5）中展开，于紫外灯（365 nm）下成像后的薄层色谱图见图 4。
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1.盐酸苯乙双胍（phenformin hydrochloride）2.盐酸二甲双胍（metformin hydrochloride）3~8.样品1~6（samples1-6） 图 4 薄层色谱图 Fig.4 Thin layer chromatograms |
取格列本脲及及样品1~6溶液各5 μL，使用薄曼联用仪自动点样，在展开剂环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（9:5:1）中展开，于紫外灯（365 nm）下成像后的薄层色谱图见图 5。
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1.格列本脲（glibenclamide）2~7.样品1~6（sample 1-6）8.格列本脲（glibenclamide） 图 5 薄层色谱图 Fig.5 Thin layer chromatograms |
薄层板在紫外灯（365 nm）下成像后，人眼识别条带及斑点，光标定位，完成点胶设置，自动点胶。
2.3.2 拉曼光谱扫描在半干不湿状态，扫描图 3中编号（条带）3、4、5、10展开后的末端斑点，获得盐酸吡格列酮、马来酸罗格列酮、样品1（条带5）斑点3、样品6（条带10）斑点2的SERS谱，见图 6。
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图 6 SERS谱 Fig.6 SERS spectra |
对样品1~6条带上的各斑点进行TLC-SERS筛查，发现样品1、样品6条带上的未知斑点，分别与盐酸吡格列酮、马来酸罗格列酮Rf值和SERS图谱相近，初步判断为疑似添加该2种化学物质，见表 2。
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表 2 6种样品中非法添加化学物质 Tab.2 Illegal added chemical substances in 6 samples |
样品1溶液，使用Q Exactive超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪测试，经HPLC-MS保留时间、母离子与碎片离子质荷比对比发现，样品1中含有盐酸苯乙双胍、盐酸吡格列酮、格列本脲3种添加物，与薄曼联用仪筛查结果一致，相关质谱图见图 7-8。
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1.盐酸苯乙双胍（phenformin hydrochloride）2.盐酸吡格列酮（pioglitazone hydrochloride）3.格列本脲（glibenclamide） 图 7 样品1中添加物质离子谱和一级质谱图 Fig.7 Primary ion spectra of the added substance in sample 1 |
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1.盐酸苯乙双胍（phenformin hydrochloride）2.盐酸吡格列酮（pioglitazone hydrochloride）3.格列本脲（glibenclamide） 图 8 样品1中添加物质二级质谱图 Fig.8 Secondary mass spectra of the added substances in Sample 1 |
样品6溶液，使用Agilent 1290-6490超高效液相质谱联用仪测试，经HPLC-MS保留时间、母离子与碎片离子质荷比对比发现，样品1中含有马来酸罗格列酮与格列本脲2种添加物，与薄曼联用仪筛查结果一致，相关质谱图见图 9。
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1.马来酸罗格列酮（rosiglitazone maleate）2.格列本脲（glibenclamide） 图 9 样品6中添加物HPLC图谱（A）、一级质谱（B）、二级质谱（C）图 Fig.9 HPLC chromatograms(A)and primary(B)and secondary(C)mass spectra of the added substance in sample 6 |
在有对照品与样品同时点样、展开、点胶与拉曼光谱扫描的情况下，斑点Rf值、荧光、SERS谱都是重要的定性依据，但在实际工作中，因为事先不知道样品里添加了何种成分，依赖对照品的测试方法将会漏掉一些非法添加化合物，如果能将降糖类可能添加的化合物SERS谱全部建立标准谱库，样品溶液展开后所有斑点都点胶、扫描SERS谱与标准谱库比对，可以实现全覆盖筛查样品中可能的非法添加物。
3.2 检测效率提高由于实现了自动点样、自动点胶，当扫描样品各斑点SERS谱能够实现与标准库的在线判别、即时反馈筛查结论时，可以解放检验人员更多精力用于样品前处理，极大提高现场检测效率。本研究由于不依赖对照品，充分利用先前建好的库资源，无论在现场初筛环节，还是在液质确证环节，都能够实现快速的要求。
3.3 展开体系优化降糖类化合物全部能被甲醇提取，但是展开效果与展开系统密切相关，建议在一块薄层板（10×10 cm）上点6~8个样，点两块板，分别用两套展开系统展开、测试，基本可以做到不遗漏。
3.4 增强基底选择实验过程中发现，盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍、盐酸吡格列酮、罗格列酮、阿卡波糖使用水胶效果较好，格列吡嗪、那格列奈、格列喹酮、瑞格列奈、格列齐特、格列本脲、格列美脲使用DMF胶效果较好。
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