2019, Vol. 39 
野菊花为菊科植物野菊（Chrysanthemum indicum L.）的干燥头状花序，性凉，味苦、辛，归肺肝经，具有清热解毒、疏风平肝的功效，主治疮痈肿、目赤肿痛、头痛眩晕等病症。现代药理学研究表明野菊花具有抗菌消炎、免疫调节、抗氧化、降压、保肝等多种药理作用[1-4]。野菊花生物活性多样，药源广泛，我国各地均产，且安全低毒[5]，具有较好的临床应用价值和潜力。野菊花中富含黄酮、酚酸、挥发油、萜等类化学成分[6-8]。药理学研究表明野菊花中黄酮类成分和咖啡酰奎宁酸类成分具有较好的抗炎、抗氧化、抗菌等作用[9-11]，与野菊花的药理活性相一致。目前，已有报道对野菊花中的单一或几个成分进行定量分析，且方法多为HPLC[12-14]，但作者采用UPLC同时测定野菊花中10个黄酮类和有机酸类成分（绿原酸、咖啡酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素、蒙花苷及芹菜素）尚属首次。本研究对不同产地野菊花药材中10个有效成分进行含量分析，为完善野菊花药材及其提取物质量控制方法提供了实验依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent1290超高效液相色谱仪（Agilent公司）；Discovery DV215CD分析天平（奥豪斯公司）；摩尔纯水机基因型1850A（重庆摩尔水处理设备有限公司）；KH3200B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，功率150 W，频率40 kHz）；Sigma 2-16KL高速冷冻离心机（Sigma公司）；AP-01P真空泵（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；XL-130多功能粉碎机（永康市小宝电器有限公司）。
1.2 试药对照品绿原酸（批号161110）、咖啡酸（批号161113）、1，3-二咖啡酰奎宁酸（批号161220）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（批号161218）、3，4-二咖啡酰奎宁酸（批号161220）、3，5-二咖啡酰奎宁酸（批号161204）、4，5-二咖啡酰奎宁酸（批号161220）、木犀草素（批号161216）、蒙花苷（批号161114）、芹菜素（批号161010）均购自北京北纳创联生物技术研究院，纯度均大于98.0%。甲醇、乙腈为色谱纯购自TEDIA公司，醋酸、磷酸为分析纯。
6批野菊花药材分别购于合肥市新同和新特药商店、安徽亳州千草国药股份有限公司、芜湖市千家惠大药房、安徽元初药房连锁有限公司、芜湖千方百剂大药房和芜湖张恒春大药房，其产地分别为湖北、浙江、安徽、河南，经安徽中医药高等专科学校汪荣斌副教授鉴定为Chrysanthemum indicum L.的干燥头状花序。
2 方法与结果 2.1 色谱条件Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相A为甲醇，B为0.3%磷酸水溶液，梯度洗脱（0~3 min，85%B→80%B；3~6 min，80%B；6~9 min，80%B→73%B；9~20 min，73%B→69.7%B；20~22 min，69.7%B→68.7%B；22~27 min，68.7%B→57%B；27~33 min，57%B→56.8%B；33~35 min，56.8%B→56.5%B；35~36 min，56.5%B→45%B；36~37 min，45%B→85%B；37~40 min，85%B）；流速0.4 mL·min-1；检测波长326 nm；柱温25 ℃；进样量2 μL。在上述色谱条件下10个成分与其他共存峰得到很好的分离，分离度均大于1.5，理论塔板数均大于10 000。见图 1。
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1.绿原酸（chlorogenic acid）2.咖啡酸（caffeic acid）3.1，3-二咖啡酰奎宁酸（1，3-dicaffeoylquinic acid）4.木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（luteolin-7-O-β-D-glucoside）5.3，4-二咖啡酰奎宁酸（3，4-dicaffeoylquinic acid）6.3，5-二咖啡酰奎宁酸（3，5-dicaffeoylquinic acid）7.4，5-二咖啡酰奎宁酸（4，5-dicaffeoylquinic acid）8.木犀草素（luteolin）9.蒙花苷（linarin）10.芹菜素（apigenin） a.浙江（Zhejiang）b.湖北（Hubei）c.安徽千方百剂大药店（Qianfang Baiji Pharmcy Store，Anhui）d.安徽元初药房（Yuanchu Pharmacy，Anhui）e.安徽毫州（Maozhou，Anhui）f.河南（Henan） 图 1 对照品（A）和野菊花样品（B）UPLC图 Fig.1 UPLC chromatograms of reference substances(A)and sample of Chrysanthemum indicum(B) |
精密称取绿原酸3.00 mg，咖啡酸1.98 mg，1，3-二咖啡酰奎宁酸2.03 mg，木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷3.06 mg，3，4-二咖啡酰奎宁酸2.10 mg，3，5-二咖啡酰奎宁酸3.01 mg，4，5-二咖啡酰奎宁酸1.98 mg，木犀草素2.10 mg，蒙花苷3.07 mg，芹菜素1.07 mg，分别置5 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得绿原酸0.600 g·L-1，咖啡酸0.396 g·L－1，1，3-二咖啡酰奎宁酸0.406 g·L-1，木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷0.612 g·L-1，3，4-二咖啡酰奎宁酸0.420 g·L-1，3，5-二咖啡酰奎宁酸0.602 g·L-1，4，5-二咖啡酰奎宁酸0.396 g·L-1，木犀草素0.420 g·L-1，蒙花苷0.614 g·L-1，芹菜素0.214 g·L-1的对照品储备液。分别精密量取绿原酸0.5 mL，咖啡酸0.125 mL，3-二咖啡酰奎宁酸0.3 mL，木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷0.4 mL，3，4-二咖啡酰奎宁酸0.3 mL，3，5-二咖啡酰奎宁酸0.6 mL，4，5-二咖啡酰奎宁酸0.6 mL，木犀草素0.35 mL，蒙花苷1.2 mL及芹菜素0.375 mL对照品溶液，置同5 mL量瓶中，定容至刻度，即得。
2.3 供试品溶液的配制称取野菊花药材粉末（过60目筛）0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按100倍药材质量的比例加入50%甲醇水40 mL，称定质量，30 ℃超声提取1 h，放至室温，再次称定质量，用50%甲醇水补足减失的量，摇匀，室温离心10 min（12 000 r·min-1），取上清液适量，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4 线性关系的考察将“2.2”项下配制的混合对照品溶液，用甲醇逐级稀释成1、2、4、8、16、20倍浓度的溶液，分别进样2 μL，以峰面积为纵坐标，以对照品质量浓度（μg·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数，见表 1。
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表 1 10个成分的线性方程、相关系数和线性范围（n=6） Tab.1 Linear equations, correlation coefficients and linear ranges of ten components |
精密吸取混合对照品溶液2 μL，依“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录峰面积，计算10个成分峰面积的RSD，结果绿原酸、咖啡酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素、蒙花苷及芹菜素的RSD分别为0.59%、0.63%、0.56%、0.55%、0.58%、0.56%、0.58%、0.78%、0.65%、1.2%，表明精密度良好。
2.6 稳定性试验取供试品溶液，分别于配制后0、3、6、9、12、24 h进样2 μL，记录峰面积，计算10个成分峰面积的RSD，结果绿原酸、咖啡酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素、蒙花苷及芹菜素的RSD分别为0.60%、0.61%、1.0%、0.92%、1.5%、0.53%、0.45%、1.3%、0.91%、2.0%，说明供试品溶液在24 h内稳定。
2.6 重复性试验精密称取同一产地野菊花样品6份，按“2.3”项下方法配制供试品溶液，按“2. 1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，根据当天随行标准曲线，计算样品各成分含量。
结果绿原酸、咖啡酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素、蒙花苷及芹菜素的平均含量分别为1.243、0.214、0.264、2.721、0.420、1.171、0.901、1.305、0.665、0.937 mg·g-1，RSD分别为0.16%、0.25%、1.3%、0.71%、0.66%、0.37%、0.53%、1.4%、1.3%、2.0%，表明该实验的重复性良好。
2.7 加样回收率试验取已知含量的野菊花样品（安徽，元初药房购入）粉末6份，每份约0.2 g，精密称定，分别置50 mL量瓶中，精密加入绿原酸、咖啡酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素、蒙花苷及芹菜素对照品储备液0.415、0.100、0.125、0.880、0.215、0.380、0.430、0.620、0.210、0.890 mL，按“2.3”项下方法制成加样供试溶液，依“2.1”项下色谱条件进行测定，计算各成分的平均加样回收率和RSD，结果见表 2。10个药效成分的平均回收率均在96.4%~103.2%，RSD均小于2.0%（n=6）。结果表明本法的准确性良好。
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表 2 野菊花中10个成分的加样回收率试验（n=6） Tab.2 Recovery of ten conponents in Chrysanthemum indicum |
精密称取6个产地野菊花粉末，按“2.3”项方法制成供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件进行测定，测定结果见表 3。
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表 3 不同产地野菊花中10个成分含量测定结果（mg·g-1，n=3） Tab.3 The contents of ten constituents in Chrysanthemum indicum from different areas |
野菊花中富含黄酮和酚酸类化合物，通过课题组前期抗氧化活性筛选，发现其中有机酸类化合物和黄酮类化合物都是野菊花中重要的药效成分之一[15]。目前野菊花药材一般以总黄酮或单一黄酮类成分，或以绿原酸作为控制质量的指标[16]。本研究对野菊花中10个黄酮类和有机酸类成分进行了含量测定，测定结果表明除咖啡酸和1，3-二咖啡酰奎宁酸的含量较低之外，其他8个成分均可以作为含量测定的指标，改善了指标成分单一性的缺点，为野菊花药材质量控制标准的建立提供方法和思路。
3.2 供试品溶液配制方法的选择本实验以待测10个成分作为指标，选用甲醇-水作为提取溶剂比较了回流提取与超声提取2种提取方法，发现2种方法得到的待测物峰面积并没有明显差异，考虑到实验操作的简便易行，故选用了超声提取的方法。在此基础上，考察了溶剂用量、浓度及提取时间对实验结果的影响，结果表明50%甲醇-水超声提取，100倍量，提取1 h即可将药材中10个成分提取完全。
3.3 高效液相色谱条件的建立用紫外分光光度计测定6个有机酸类成分的最大吸收波长均为（326 ± 2）nm，而参考相关文献[17]，发现另外4个黄酮成分的最大吸收波长分别为木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷348 nm、蒙花苷326 nm和木犀草素346 nm、芹菜素336 nm，考虑到《中华人民共和国药典》2015年版中野菊花的指标性成分是蒙花苷，故最终选择以326 nm作为检测波长。在流动相系统的选择中，先后试用了4种流动相系统：乙腈-水-0.3%磷酸、乙腈-水-2.5%醋酸，甲醇-水-2.5%醋酸、甲醇-水-0.3%磷酸，结果表明，使用乙腈-水-0.3%磷酸、乙腈-水-2.5%醋酸、甲醇-水-2.5%醋酸系统时，10个成分尤其是木犀草素和蒙花苷难以达到基线分离，而使用甲醇-水-0.3%磷酸系统，混合对照品和样品中10个成分均达到了基线分离，通过不同比例的摸索，最终确定甲醇-水-0.3%磷酸梯度洗脱，10个成分均能获得较好的分离效果。
3.4 含量测定结果分析含量测定结果表明，10个成分在不同产地的野菊花药材中的含量差异显著，其内在质量差异较为明显。2015年版《中华人民共和国药典》中野菊花的指标性成分为蒙花苷，其在部分产地之间的含量差异甚至可以达到几十倍，且湖北、河南、安徽（元初药房购买）产地野菊花药材中蒙花苷含量均未达到2015年版《中华人民共和国药典》要求。表明市售野菊花药材可能由于产地、加工炮制方法等因素导致其内在质量出现差异，其市售药材质量有待进一步加强质控，而对野菊花中的多种成分进行同步测定可以更加全面地反映野菊花的内在质量。
野菊花作为常用中药应用广泛，本实验建立了超高效液相色谱同时测定野菊花药材中10个成分含量的方法，并且从中选取8个含量较高的成分作为野菊花质量控制的指标成分。该方法简便、快速，具有较好的准确度和精密度，与HPLC相比节约了分析时间，节省了溶剂，能简单有效地评价野菊花中主要的黄酮和有机酸类成分，有助于实现现代中药的多维质量控制，为进一步完善野菊花药材的质量控制标准提供参考依据。
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