抗生素类药物在治疗人类及动物的感染性疾病中发挥了重要作用，但抗生素滥用会造成严重不良后果。研究发现，人类长期使用含有抗生素残留的食品或药品，抗生素可在体内蓄积，导致人体肠道菌群失调，引起易感个体出现过敏和变态反应，或者使细菌耐药性增加等，危害人体健康^[1-2]，因此，应严格控制食品、药品中残留的抗生素。《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2015年版三部凡例中规定：生物制品生产过程中应尽量避免使用抗生素；必须使用时，应选择安全性风险相对较低的抗生素，使用抗生素的种类不得超过1种，且产品的后续工艺应保证可有效去除制品中的抗生素，去除工艺应经验证；生产过程中使用抗生素时，成品检定中应检测抗生素残留量，并规定残留量限值^[3]。

卡那霉素属氨基糖苷类抗生素，是生物技术药物筛选和生产中常用的一种抗生素，具有神经毒性和肾脏毒性，损害第8对脑神经，导致前庭和耳蜗损伤，肾毒性主要表现为近端身曲管损伤，出现蛋白尿、血尿、肾功能减退等^[4-5]。《中国药典》收录的抗生素残留量检查采用传统的微生物检测法，该法特异性较差，容易受到非抗生素抑菌剂的影响^[6]。本文以注射用重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白(简称TMP-Fc)制品为例，采用直接竞争ELISA，建立了定量限更低、更灵敏便捷的卡那霉素含量测定方法。

依据药品审评中心2005年12月《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》^[7]，对该方法的专属性、重复性、精密度和准确度进行验证，证明该方法能较好地应用于注射用TMP-Fc产品的卡那霉素残留检测，在药物研制和大规模生产中进行有效的质量控制。

1 材料 1.1 样品

注射用TMP-Fc成品(D140115)及空白溶液(即辅液)为北京泰德制药股份有限公司提供。

1.2 仪器与试剂

酶标仪(Epoch)购自美国Bio-tek；卡那霉素残留ELISA检测试剂盒购自北京中检维康技术有限公司，其中包括5个浓度的卡那霉素标准品；卡那霉素标准品(批号130556)购自中国食品药品检定研究院；氨苄青霉素(批号15L040005)为VWR公司产品；盐酸四环素(批号1975C044)为Amresco产品。

2 方法与结果 2.1 卡那霉素含量标准曲线建立

试剂盒中提供的卡那霉素标准品质量浓度分别为0、0.2、0.5、1.0、3.0 ng·mL^-1，每个稀释度做2个平行复孔；按照试剂盒说明书，加入标准品溶液75 μL至相应的稀释微孔板中，然后每孔加入卡那酶标抗原75 μL。将多道移液器调至100 μL，每孔混匀5次后，吸取混合溶液100 μL，加至包被有抗体的酶标微孔板中，37℃避光孵育30 min；倒出孔内液体，将微孔板倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体，然后每孔加入稀释好的洗涤液250 μL洗涤4次，洗板时每次间隔20 s，用吸水纸拍干；每孔加入显色底物100 μL，室温避光温育10 min；每孔加入反应终止液50μL，振荡混匀；用酶标仪在450 nm处测定吸光度，参比波长630 nm。将A₄₅₀-A₆₃₀的数据输入Ridasoft Win分析软件中进行计算，以卡那霉素标准品浓度为横坐标，百分吸光度值为纵坐标，采用spline拟合方式进行处理：卡那霉素含量在0.2~3.0 ng·mL^-1之间用此方法检测线性良好，标准品实测值与理论值RSD小于1.0%，且2个平行复孔间RSD小于10%(相对标准偏差(RSD)=标准偏差(SD)/算术平均值×100%)，见图 1和表 1。本方法定量下限依据试剂盒中的规定，最低检测限度为0.2ng·mL^-1，低于此浓度的样品卡那霉素含量判定为阴性。

2.2 专属性验证

为了解分析方法的合理性，应首先考虑专属性研究。用该方法对1.0 ng·mL^-1的卡那霉素标准品(批号130556)溶液进行3次测定，阳性率为100%；对1.0 ng·mL^-1的氨苄青霉素、盐酸四环素溶液进行3次测定，检测结果均为阴性。

TMP-Fc成品中含有一定浓度的辅料，应考察辅料成分对卡那霉素检测是否产生干扰。用超纯水配制不含有TMP-Fc蛋白的空白辅液，将此空白溶液作为样品进行3次测定，检测结果与标准曲线中0 ng·mL^-1接近，对样品检测无干扰。

上述结果表明，本方法和试剂盒具有较好的专属性。

2.3 TMP-Fc成品中卡那霉素残留量及重复性验证

用试剂盒中提供的稀释缓冲液将TMP-Fc成品复溶并稀释5/10倍，稀释5倍的样品与1.0 ng·mL^-1标准品等体积混合作为供试品，各个样品按照试剂盒说明书进行3次平行检测，每次2个复孔，用酶标仪在450 nm/630 nm处测定吸光度，将A₄₅₀-A₆₃₀的数据输入Ridasoft Win分析软件中进行计算，与标准曲线比较再乘以其对应稀释倍数，即为样品中卡那霉素含量。

TMP-Fc成品吸光度值超出最低检测限，平行3次测定结果(卡那霉素浓度ng·mL^-1(RSD%)为0.14(7.1%)、0.03(5.3%)、0.04(5.6%)。卡那霉素残留量的检测结果均小于0.2 ng·mL^-1，即TMP-Fc成品卡那霉素残留量判定为阴性。

由于TMP-Fc成品卡那霉素残留为阴性，采用加标样品评价该方法的重复性。加标样品平行3次测定，结果卡那霉素浓度分别为0.44、0.55、0.46 ng·mL^-1，RSD分别为8.4%、2.7%、4.2%。复孔RSD均小于10%，复孔平行性良好。3次平行实验RSD为12.1%，此方法重复性较好。

2.4 TMP-Fc成品中卡那霉素残留量、中间精密度及准确度验证

将复溶后稀释5倍的TMP-Fc成品分别等体积加入0.5、1.0、2.0、6.0ng·mL^-1卡那霉素标准品溶液，用酶标仪于450 nm/630 nm双波长进行测定，所得数据A₄₅₀-A₆₃₀用Ridasoft Win软件进行分析，与标准曲线比较再乘以其对应稀释倍数，即为样品中卡那霉素含量。回收率计算公式：回收率=(加标样品测定值-样品测定值)/加标样品理论值×100%，因TMP-Fc成品测定值低于检测限，计算回收率时忽略不计。

以0.25、0.5、1.0、3.0 ng·mL^-1卡那霉素加标样品进行板间精密度分析，检测结果见表 2。板内复孔RSD在1.3%~8.7%之间，均小于10%，复孔平行性良好。3次测定的板间RSD在12.7%~17.6%之间，均低于20%，说明本方法具有较理想的中间精密度。4个不同浓度的加标样品进行3次重复测定，计算得到本实验的回收率在101.3%~106.4%之间，表明该方法具有较好的准确度。

3 讨论

抗生素残留量的检测常用3种方法：微生物学方法、免疫分析法和理化法。微生物学方法^[8-10]因灵敏度不高，容易受到菌种敏感性、培养基配方、pH等因素干扰，而且不能区分具体是哪一种抗生素，使用受到限制；理化法如高效液相色谱蒸发光散射法(HPLC-ELSD)^[11]和毛细管区带电泳^[12]，由于设备昂贵，要求高，程序复杂等，使应用受到限制；免疫分析方法在灵敏度、特异性、快速性、高通量等方面具有较大优势，得到广泛应用。

ELISA是当前应用最广、发展最快的免疫分析方法，自1971年首次建立以来，经过40余年的发展，现已成为药物残留中最重要的分析技术之一^[13]。与其他方法相比较，ELISA具有以下优点：较高特异性和灵敏度；检测范围^{[6, 14]}在ng甚至pg水平，属于超微量分析技术；结果准确，重现性好，方法操作简便且可进行大样本量分析。

已有文献^[6]报道采用间接竞争ELISA方法检测卡那霉素残留量，其定量下限为0.5 ng·mL^-1。本文采用直接竞争ELISA方法检测重组生物制品中的卡那霉素残留量，试剂盒定量下限为0.2 ng·mL^-1，该方法较间接ELISA法更为便捷。

依据《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》^[7]，对直接竞争ELISA方法进行验证：该方法专属性良好，不受其他抗生素干扰；灵敏度高，在0.2~3.0 ng·mL^-1范围内spline拟合良好，且平行复孔间RSD小于10%；精密度良好，重复性RSD小于15%，中间精密度RSD低于20%；准确度良好，加标回收率在80%~120%之间。

运用ELISA法对重组技术制品的原液、成品进行卡那霉素残留量检测，可以引入回收率、专属性等对反应体系及干扰因素进行评价；该方法灵敏度高，操作便捷，可以有效节省检测时间，并进行样品批量检测，适用于重组技术制品研发及生产过程中卡那霉素残留量检测。