2019, Vol. 39 
2. 三峡中心医院药学部, 万州 404100;
3. 陆军军医大学第二附属医院, 重庆 400000
2. Pharmacy Department of Sanxia Central Hospital, Wanzhou 404100, China;
3. The Second Affiliated Hospital of Army Medical University, Chongqing 400000, China
伏立康唑是第一个发现的第二代三唑类广谱抗真菌药, 临床广泛用于治疗曲霉菌、念珠菌、隐球菌等真菌所致的侵袭性感染[1]。体外实验表明, 伏立康唑是CYP2C19、CYP2C9和CYP3A4的底物[2], 总血药浓度受CYP2C19基因多态性的影响显著[3]。大量研究显示, 在相同给药剂量下, 不同CYP2C19基因型的患者总血药浓度有显著差异; 但是, 相同的伏立康唑总血药浓度下, 临床疗效也存在差异[4], 导致这种情况发生的原因尚不明确。
药物进入体内分布后, 以游离型和结合型2种形式存在, 其中只有游离型的药物发挥药理作用。常规血药浓度监测方法测得的为药物总血药浓度[5-6], 并不能准确反映发挥药理作用部分的游离型药物浓度（unbound concentration, Cu）。伏立康唑是重症患者和血液系统疾病移植患者侵袭性真菌感染的一线治疗药物, 由于重症患者特殊的病理生理状态, 影响伏立康唑血浆蛋白结合率的因素众多, 导致在相同的总血药浓度下, 游离型药物浓度不同, 产生的药理作用也不相同, 这可能是相同血药浓度产生不同临床疗效的原因。本研究通过检测三峡中心医院使用伏立康唑进行治疗的患者的CYP2C19基因型和伏立康唑游离型药物浓度, 分析CYP2C19基因多态性与伏立康唑游离型药物浓度的相关性。
1 资料与方法 1.1 纳入与排除标准纳入标准:（1）三峡中心医院住院患者; （2）年龄18~90周岁; （3）分别参照《中国重症患者侵袭性真菌感染诊断与治疗指南（2007）》[7]或《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗指南（第四次修订版）》[8]诊断标准, 确诊或拟诊为侵袭性真菌感染者; （4）采用伏立康唑负荷剂量（首个24 h, 6 mg·kg-1, 静脉滴注, 每12 h给药1次）, 之后采用维持剂量（4 mg·kg-1, 静脉滴注, 每12 h给药1次）治疗超过48 h, 以保证药物浓度达到稳态。
排除标准:（1）中、重度肾功能损害患者（肌酐清除率≤50 min·mL-1）; （2）重度肝功能异常患者, 丙氨酸转氨酶或天冬氨酸转氨酶超过正常值的3倍, 或Child-Pugh评分≥10分）; （3）参加其他临床试验; （4）拒绝知情同意; （5）经医师综合评定不宜纳入研究者。
1.2 研究对象本研究方案经医院医学伦理委员会审核并通过, 选取2016年3月-2017年6月三峡中心医院使用伏立康唑治疗的住院患者。
1.3 治疗方法所有患者均静脉输注注射用伏立康唑（0.1 g, 丽珠集团丽珠制药厂）, 标准剂量给药, 即首日给予负荷剂量6 mg·kg-1, 每12 h给药1次, 24 h后给予维持剂量4 mg·kg-1, 每12 h治疗1次, 以使血药浓度尽快达到稳态。
1.4 伏立康唑游离型药物浓度测定首次给药48 h后, 所有患者于下次给药前0.5~1 h, 抽取静脉血0.5 mL, 使用Millipore Centrifree超过滤装置（美国Millipore公司）超滤离心提取游离型伏立康唑, 使用岛津LC-20A型高效液相色谱仪（配有LC-20A型溶剂泵、二极管阵列检测器, 日本岛津公司）, Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×200 mm, 5 μm, 广州迪马公司）, 以乙腈-水（35:65）为流动相, 1.0 mL·min-1的流速进样超滤提取液, 记录265 nm处高效液相色谱图, 以外标法测定伏立康唑的游离型药物浓度, 具体方法详见已研究结果[9]。
1.5 CYP2C19基因型分析取任意血常规检测后剩余血样500 μL, 提取基因组DNA, 使用CYP2C19基因检测试剂盒（上海百傲生物, DNA微阵列芯片法）, 用CYP2C19基因特异引物对1和引物对2进行聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）扩增。PCR反应体系:取CYP2C19基因检测试剂盒中CYP2C19扩增液1（内含CYP2C19基因特异引物对1, 氯化钾, Tris-HCL缓冲液, 氯化镁等, 上海百傲生物）和CYP2C19扩增液2（内含CYP2C19基因特异引物对2, 氯化钾, Tris-HCL缓冲液, 氯化镁等, 上海百傲生物）各19 μL, 置0.2 mL PCR离心管中, 加入反应液A（含Taq酶, UNG酶, 上海百傲生物）1 μL, DNA提取溶液5 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性25 s, 48 ℃退火40 s, 72 ℃延伸30 s, 共35个循环, 最后72 ℃再延伸5 min。使用BaiOe-Hyb全自动杂交仪（上海百傲生物）, 将带标记的产物与固定在醛基片上的CYP2C19基因型检测探针进行特异杂交反应, 并通过酶促显色, 使特异杂交信号显色; 使用BaiO基因芯片图像分析仪对芯片进行扫描, 得到样本DNA扩增产物与每个基因位点的野生型和突变型探针杂交形成杂交图像, 通过（BaiO Array Doctor）V 2.0软件分析该图像, 检测待测样本的基因型。检测输出的6种基因型结果中, CYP2C19 *2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3为慢代谢型（poor metabolizer, PM）; CYP2C19 *1/*2、CYP2C19 *1/*3为中等代谢型（inter metabolizer, IM）; CYP2C19 *1/*1为快代谢型（extensive metabolizer, EM）[10]。
1.6 数据处理方法自制病例报告表记录患者基本信息, 包括姓名、性别、年龄、ID、床号、诊断, 伏立康唑给药剂型、首次给药日期, 血药浓度测定取样日期和时间点, 肝肾功能等相关指标和游离型药物浓度测定结果。
在排除性别、年龄、体重影响的情况下, 考察CYP2C19基因多态性对伏立康唑游离型药物浓度的影响。采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示, 3种CYP2C19基因亚型组间比较采用单因素方差分析; 采用LSD法进行组间多重比较。P < ;0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 患者一般资料和游离型浓度本研究共纳入患者78例, 男女比例约1.5:1, 年龄[53.86±18.5（18~87）]岁, 伏立康唑游离型药物浓度为2.330±1.088（0.343~5.060）]mg·mL-1。78例患者经基因型分析, 结果显示33例（42.3%）为快代谢型（EM型）, 28例（35.9%）为中等代谢型（IM型）, 17例（21.8%）为慢代谢型（PM型）, 78例使用伏立康唑进行治疗患者一般资料见表 1, 1例快代谢型患者基因检测结果表 2, 伏立康唑游离型药物浓度测定色谱图见图 1。患者均为重症患者, 合并多种疾病诊断, 均有侵袭性真菌感染的临床适应症。
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1.伏立康唑（voriconazole）A.对照品（reference substance）B.血浆样本（plasma sample） 图 1 伏立康唑游离型药物浓度测定色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms in the determination of unbound concentration of voriconazole |
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表 1 78例使用伏立康唑进行治疗患者一般资料 Tab.1 General conditions of 78 patients treated with voriconazole |
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表 2 1例快代谢型（EM）患者基因检测结果 Tab.2 Result of CYP2C19 genotype for a extensive metabolizer(EM)sample |
CYP2C19 3种基因亚型患者年龄、体重和伏立康唑游离型药物浓度均满足方差齐性, 结果以x±s表示, 结果见表 3。首先, 采用独立样本t检验, 发现性别对伏立康唑游离型药物浓度无显著影响（P > 0.05）; 其次, 采用单因素方差分析, 比较CYP2C19 3种基因亚型患者年龄、体重和伏立康唑游离型药物浓度差异, 结果显示, 3种CYP2C19 3种基因亚型患者年龄和体重无显著差异（P > 0.05）, 伏立康唑游离型药物浓度有显著差异（P < ;0.01）。采用LSD（least significant difference, 最低显著性差异）法对3种CYP2C19基因亚型的伏立康唑游离型药物浓度进行多重比较, 发现3种CYP2C19基因亚型间游离型药物浓度均有差异, 表现为PM型 > IM型 > EM型, P均小于0.05, 3种基因亚型结果见表 4。
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表 3 按基因亚型分组后患者一般情况和游离型伏立康唑浓度（x±s） Tab.3 General conditions and Cu of groups by CYP2C19 subtypes |
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表 4 3种CYP2C19基因亚型的伏立康唑游离型浓度差异的多重比较 Tab.4 Multiple comparisons of Cu between the three CYP2C19 subtypes |
伏立康唑的体内代谢具有非线性动力学的特征, 增加相同的给药剂量, 在不同患者体内呈现不同程度的药物-时间曲线下面积变化, 临床表现为血药浓度的个体差异较大。已有研究表明, 患者的年龄、性别、身体质量指数、N-代谢产物、CYP2C19等因素的个体差异都会影响伏立康唑的总血药浓度[4, 11-12]; 同时, 由于伏立康唑用于治疗侵袭性真菌感染, 感染者大多基础疾病多, 病理生理状态特殊[7], 同服药物、血浆白蛋白浓度、胆红素浓度和一些游离脂肪酸的变化都会影响伏立康唑的体内分布特征[13], 从而可能造成最终发挥药理作用的游离型药物浓度占总血药浓度的比例发生变化。所以, 研究伏立康唑的游离型药物浓度, 相对于总血药浓度具有更直接的临床意义。
本研究通过收集使用伏立康唑进行侵袭性真菌感染治疗患者的血浆样本, 分析CYP2C19基因型, 测定伏立康唑游离型药物浓度并记录患者年龄、性别、体重等基本资料, 通过公斤/体质量方式调整给药剂量, 以排除患者体质量对游离型药物浓度的影响。所纳入的78例患者中, 快代谢型33例（42.3%）、中等代谢型28例（35.9%）、慢代谢型17例（21.8%）。采用独立样本t检验显示, 患者性别对伏立康唑的游离型药物浓度无显著影响, 单因素方差分析显示3组CYP2C19基因型患者年龄、体重无差异（P > 0.05）, 伏立康唑游离型浓度有显著差异（P < ;0.05）。采用LSD法对3组基因型进行两两比较, 结果显示3组基因型之间伏立康唑游离型浓度均呈显著差异, 表现为PM型患者伏立康唑游离型浓度高于IM型和EM型, IM型患者伏立康唑游离型浓度高于EM型, 该研究结论与已有的针对患者伏立康唑总血药浓度的研究结果一致[14], 表明在侵袭性真菌感染患者复杂的病理生理状态下, 即使白蛋白水平、胆红素浓度波动等可能影响伏立康唑蛋白结合率, 肾脏功能状态、补液、引流等可能影响伏立康唑排泄率和表观分布容积的情况下, CYP2C19基因多态性仍会显著影响患者体内伏立康唑的有效血药浓度, 即游离型药物浓度。所以, 临床上对于使用伏立康唑治疗的患者进行CYP2C19基因检测, 参照CYP2C19基因型调整伏立康唑的给药剂量, 具有重要意义。
该研究也存在一些不足之处。由于患者大多数处于昏迷状态, 导致肝功能损害的因素众多, 所以无法观察其视觉障碍、肝酶谱升高等不良反应; 也由于经验性治疗、抢先治疗在侵袭性真菌感染治疗中非常常见, 且导致患者死亡的原因也是方方面面的, 故而无法对其疗效进行评价。即使一些文献进行了疗效评价[15-16], 其结论也可能存在争议。所以, 在临床实践中, 由于疗效、不良反应的监测比较困难, 为保证患者用药的安全、有效, 测定伏立康唑的游离型药物浓度, 可排除体内过程中的干扰, 得到了真正发挥药理作用的药物浓度, 有利于实现治疗药物浓度监测的精准化。对于影响伏立康唑游离型药物浓度的其他因素, 也需要更多的临床研究来证明。
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