眼用制剂系指直接用于眼部发挥治疗作用的无菌制剂^[1]。目前，国内市场上的眼用制剂大多数为多剂量包装，为了防止眼用制剂在使用和保存过程中被泪液及环境中的微生物污染，多数眼用制剂(包括抗生素类)中都添加有抑菌剂^[2]。抑菌剂的选择受其抗菌谱、配伍禁忌、产品pH、增稠剂以及浓度等多方面因素的影响^[3]，不合理应用不仅会影响滴眼剂的质量，还可能产生毒副作用；另一方面，抑菌剂本身也具有一定的毒性。近年来。有关滴眼剂中抑菌剂毒性反应以及对眼组织损害的报道也日益增多^[4-6]，特别是需要长期使用的滴眼剂，如用于治疗青光眼的滴眼剂^[7-8]。因此，抑菌剂的合理使用和质量控制已经成为保证眼用制剂安全性、有效性的关键问题之一^[9-11]。为此，《中国药典》2015年版对于新药处方筛选时抑菌剂的含量和抑菌效力检查有了更加严格的规定^[12]。但是，对于如何解决目前国内已上市产品抑菌剂使用的乱象，采用何种措施逐步推进制剂的升级换代，依然是需要解决的遗留问题^[13]。

盐酸洛美沙星滴眼液是临床上常用的用于治疗细菌感染性外眼疾病的眼用制剂^[14]。2016年吉林省药品检验所承担了盐酸洛美沙星滴眼液国家药品计划抽验评价任务，分别从来自30个省的生产、经营和使用单位共抽取了盐酸洛美沙星滴眼液153批次，涉及13个生产厂家，基本涵盖了目前国内市场全部在售盐酸洛美沙星滴眼液。抽验产品规格均为多剂量包装。本文通过对这13家企业盐酸洛美沙星滴眼液中抑菌剂的种类、抑菌效力、含量以及包装材料对于抑菌剂影响等的分析，揭示了目前国产盐酸洛美沙星滴眼液中抑菌剂使用的不合理现象，为企业下一步优化处方，提高产品质量提供了科学依据。

本实验共涉及抑菌效力检查、抑菌剂含量测定、冻融实验、包装材料与抑菌剂相互作用考察四项主要研究工作，其中使用到的主要仪器包括：Thermo SCIENTIFIC KS18生物安全柜、上海成顺JC303A-5电热恒温培养箱、TOMY Autoclave SS-325高压蒸汽灭菌器、Agilent 1200高效液相色谱仪、梅特勒-托利多AG135和MS105电子天平；GZX-9023MBE鼓风干燥箱；DFD-700恒温水浴；FE20 plus酸度计。

实验中用到的主要试剂和标准物质包括：中国食品药品检定研究院100847-201203批羟苯乙酯对照品(含量100%)、100278-201404批羟苯甲酯对照品(含量100%)、135051-201401批苯扎溴铵对照品(含量100%)；国药集团化学试剂有限公司20160327批苯扎氯铵，含量98.4%；Dr. Ehrenstorfer GmbH 40707批硫柳汞对照品，含量99.2%。水为超纯水，甲醇为Fisher Chemical公司色谱纯产品，磷酸和三乙胺均为天津市科密欧化学试剂有限公司色谱纯产品。

实验中用到的菌种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]、大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]均来自中国食品药品检定研究院，工作菌株为第3代。胰酪胨大豆肉汤培养基、胰酪胨大豆琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基和pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液均购自北京奥博星有限公司。

实验中所用供试品盐酸洛美沙星滴眼液均来自2016年吉林省药品检验所承担的国家药品计划抽验项目，共涉及13个厂家138批次。经处方分析，其中11家企业处方中使用了抑菌剂，抑菌剂的使用率为84.6%。各企业应用的抑菌剂主要有以下4类：5家企业使用了对羟基苯甲酸酯类——羟苯甲酯或羟苯乙酯，使用浓度范围0.01%~0.06%；4家企业使用了季铵盐类抑菌剂——苯扎溴铵或苯扎氯铵，使用浓度范围0.001%~0.02%；各有1家企业使用了硫柳汞和三氯叔丁醇作为抑菌剂，分属有机汞类和醇类抑菌剂，使用浓度分别为0.015%和0.35%。

另外，实验中使用的低密度聚乙烯瓶购自金坛市民康医疗器械有限公司(批号151205)。

依据《中国药典》2015年版四部《1121抑菌效力检查法》测定盐酸洛美沙星滴眼液的抑菌效力^[15]，结果详见表 1。

表 1 Table 1

表 1 抑菌效力实验结果 Table 1 The results of the antimicrobial effectiveness test 生产企业编号 (manufacturer No.) 抑菌剂种类 (antimicrobial agent) 处方浓度 (dosage)/% 细菌 (bacteria) 真菌 (fungi) 抑菌效力 (antimicrobial effectiveness) 1 苯扎溴铵(benzalkonium bromide) 0.02 A A A 2 苯扎溴铵(benzalkonium bromide) 0.01 A A A 3 苯扎氯铵(benzalkonium chloride) 0.01 A A A 4 三氯叔丁醇(acetone chloroform) 0.35 A A A 5 硫柳汞(mercurothiolate) 0.015 A A A 6 羟苯乙酯(ethyl p-hydroxybenzoate) 0.06 A B B 7 羟苯乙酯(ethyl p-hydroxybenzoate) 0.05 A B B 8 羟苯乙酯(ethyl p-hydroxybenzoate) 0.03 A B B 9 羟苯乙酯(ethyl p-hydroxybenzoate) 0.01 A C* C 10 苯扎溴铵(benzalkonium bromide) 0.001 B C C 11 羟苯甲酯(methyl p-hydroxybenzoate) 0.02 B C C 12 — — B C C 13 — — B C C *未达到《中国药典》规定的抑菌效力标准(not comply with the requirements of antimicrobial efficacy of Chinese Pharmacopoeia)

表 1 抑菌效力实验结果 Table 1 The results of the antimicrobial effectiveness test

从表 1可见，各企业处方不同，其样品抑菌效力差异显著。处方中未添加抑菌剂的12号企业和13号企业样品未达到《中国药典》规定的抑菌效力标准，说明虽然本品为抗生素类药物，但受抗菌谱范围的限制，对抗菌谱以外的微生物起不到抑菌作用，如需多剂量使用，仍需选择恰当的抑菌剂，保证其在多次使用和存储过程中不被微生物污染。处方中添加抑菌剂浓度过低的9号、10号和11号企业样品也未达到《中国药典》规定的抑菌效力标准，说明本品不宜选用较低浓度的苯扎溴铵、羟苯乙酯和羟苯甲酯作为抑菌剂。而达到《中国药典》规定的抑菌效力标准的企业处方中加入的同种抑菌剂浓度差异较大，如1号企业是2号、3号企业处方中苯扎溴铵加入量的2倍，也是国家食品药品监督管理总局药品审评中心网站辅料数据库中标明苯扎溴铵在眼用制剂中使用限值(0.01%)的2倍；另外处方中6号企业与7号企业羟苯乙酯的加入量约为8号企业的2倍。对于制剂中抑菌剂的添加应遵循最低有效原则，即在保证足够抑菌能力的前提下越少添加越好，因此建议1号、6号和7号企业根据抑菌剂的使用限制结合抑菌效力的测定结果考察处方合理性。

参考文献[16]建立高效液相色谱方法^[16]测定供试品中羟苯甲酯、羟苯乙酯、硫柳汞、苯扎溴铵、苯扎氯铵的含量；气相色谱方法测定供试品中三氯叔丁醇含量(未发表资料)，限度均定为标示量的80.0%~120.0%，11个厂家136批次供试品中抑菌剂的含量详见表 2。由表 2可见，苯扎溴铵、苯扎氯铵、羟苯甲酯的合格率为100%；不合格抑菌剂种类为羟苯乙酯、硫柳汞和三氯叔丁醇。

表 2 Table 2

表 2 抑菌剂含量测定结果 Table 2 The determination.n results of antimicrobial agents in lomefloxacin hydrochloride eye drops 生产企业编号 (manufacturer No.) 测量批次 (batches) 抑菌性种类 (antimicrobial agent) 处方量 (dosage)/% 测得量 (content range)/% 不合格批次 (unqualified batches) 不合格率 (unqualified rate)/% 1 3 苯扎溴铵(benzalkonium bromide) 0.02 0.020~0.021 0 0 10 22 苯扎溴铵(benzalkonium bromide) 0.001 0.000 8~0.001 1 0 0 3 4 苯扎氯铵(benzalkonium chloride) 0.01 0.011 0 0 11 9 羟苯甲酯(methyl p-hydroxybenzoate) 0.02 0.020~0.021 0 0 8 4 羟苯乙酯(ethyl p-hydroxybenzoate) 0.03 0.028~0.031 0 0 5 16 硫柳汞(mercurothiolate) 0.015 0.010~0.014 4 25 2 16 苯扎溴铵(benzalkonium bromide) 0.01 0.008~0.009 0 0 6 7 羟苯乙酯(ethyl p-hydroxybenzoate) 0.06 0.052~0.058 0 0 4 2 三氯叔丁醇(acetone chloroform) 0.35 0.26~0.28 1 50 7 13 羟苯乙酯(ethyl p-hydroxybenzoate) 0.05 0.028~0.050 1 7.7 9 40 羟苯乙酯(ethyl p-hydroxybenzoate) 0.01 0.009~0.010 0 0 合计(total) 136 — — — 6 4.4

表 2 抑菌剂含量测定结果 Table 2 The determination.n results of antimicrobial agents in lomefloxacin hydrochloride eye drops

针对抑菌剂含量测定中不合格产品使用的抑菌剂羟苯乙酯、硫柳汞以及三氯叔丁醇进行深入研究，调查其不合格原因的同时，探讨其处方中抑菌剂选择的合理性。

取全部13家企业样品各3批，对其进行冻融实验，条件如下：置-18 ℃2 d，取出后置40 ℃干燥箱中2 d，如此循环3次。结果如表 3，发现6、7和8号企业的样品均有结晶状物析出，将析出结晶的样品置80 ℃水浴10 min，结晶物溶解消失。进一步分析发现，未通过冻融实验样品中均添加了较高浓度的羟苯乙酯作为抑菌剂。羟苯乙酯为脂溶性，而供试品处方中其他组分均为水溶性，羟苯乙酯与其他组分溶解度差异显著，推测样品水溶液在低温环境下容易析出羟苯乙酯的晶核，主成分的溶质颗粒附着在羟苯乙酯的晶核上，进而导致了羟苯乙酯和洛美沙星的析出。再次回顾分析羟苯乙酯含量不符合规定的7号企业产品，发现其样品的性状、可见异物、含量亦不符合规定，而该样品生产地点为东北，生产时间为冬季，初步推测贮运温度过低使得羟苯乙酯和洛美沙星析出是导致该产品多个检测项目不符合规定的主要原因之一。

表 3 Table 3

表 3 样品冻融试验结果 Table 3 Results of the freeze-thaw test 生产企业编号 (manufacturers No.) 冻融试验结果 (result of the freeze-thaw test) 室温放置2 d后 (result of the samples after freeze-thaw test in room temperature for 2) 置80 ℃水浴10 min (result of the samples after freeze-thaw test in water bath at 80 ℃for 10 min) 1 未析出 (clear solution) — — 10 未析出 (clear solution) — — 3 未析出 (clear solution) — — 11 未析出 (clear solution) — — 8 析出晶体 (crystal precipitation) 析出 (crystal precipitation) 结晶溶解，溶液澄清 (Crystal precipitation was dissolved and the solution was clear again.) 5 未析出 (clear solution) — — 2 未析出 (clear solution) — — 6 析出 (crystal precipitation) 析出 (crystal precipitation) 结晶溶解，溶液澄清 (Crystal precipitation was dissolved and the solution was clear again.) 4 未析出 (clear solution) — — 7 析出 (crystal precipitation) 析出 (crystal precipitation) 结晶溶解，溶液澄清 (Crystal precipitation was dissolved and the solution was clear again.) 9 未析出 (clear solution) — — 12 未析出 (clear solution) — — 13 未析出 (clear solution) — —

表 3 样品冻融试验结果 Table 3 Results of the freeze-thaw test

结合抑菌效力检查结果，低浓度羟苯乙酯达不到要求的抑菌效力，高浓度的羟苯乙酯虽然抑菌效力满足条件，但又存在结晶析出的风险。因此，目前使用羟苯乙酯为抑菌剂的盐酸洛美沙星滴眼液产品，其处方设计存在一定的不合理性，建议这些企业本着最低有效原则，进一步优化羟苯乙酯的浓度或者更换为更为理想的抑菌剂，另外目前为规避潜在的质量风险提示应关注样品的贮藏和运输条件。

文献报道，三氯叔丁醇易被聚乙烯容器吸收且在pH大于5.5时，其活性和稳定性下降^[3]。检查发现，所有供试品包装材料均为低密度聚乙烯瓶。且标准规定盐酸洛美沙星滴眼液pH的范围是5.0~6.5，供试品pH的实测范围更窄，是5.4~6.0。模拟4号企业的处方和生产工艺，分别制成pH 5.6的模拟样品置玻璃容器中，pH 3.0的模拟样品置玻璃容器中、pH 3.0的模拟样品置低密度聚乙烯瓶中，考察了40 ℃3个月内三氯叔丁醇的稳定性。

实验结果如图 1所示，玻璃瓶中pH 3.0的模拟样品3个月内三氯叔丁醇的含量没有改变，而玻璃容器中pH 5.6的模拟样品和低密度聚乙烯瓶中pH 3.0的模拟样品三氯叔丁醇的含量降低了近15%，说明样品的pH条件和包装材料显著影响了三氯叔丁醇的稳定性，推测这可能是4号企业产品三氯叔丁醇含量不合格的主要原因。

A. pH 5.6玻璃容器(pH 5.6 glass container) B. pH 3.0玻璃容器(pH 3.0 glass container) C. pH 3.0低密度聚乙烯瓶(pH 3.0 low density polyethylene bottle) 图 1 三氯叔丁醇的稳定性考察 Figure 1 Results of stability test for acetone chloroform

文献报道，硫柳汞易被聚乙烯包装材料吸附^[3]。模拟5号企业处方工艺自制样品，分别置于低密度聚乙烯瓶和玻璃瓶内，于40 ℃同时避光放置3个月后，分别测定采用2种不同包装材料的滴眼液中硫柳汞的含量，以考察正常使用环境中包装材料对硫柳汞的吸附性。实验结果如图 2所示，采用2种不同包装的滴眼液结果差异显著，提示聚乙烯类包装材料对硫柳汞可能有显著的吸附作用，推测这可能是5号企业产品中硫柳汞含量不合格的主要原因。

A.白色低密度聚乙烯瓶(white low density polyethylene bottle) B.棕色玻璃瓶(brown glass bottle) 图 2 包装材料对硫柳汞的吸附性 Figure 2 The absorbability of packaging materials to mercurothiolate

对目前13家生产盐酸洛美沙星滴眼液的国产企业产品进行系统分析，通过抑菌效力检查实验发现，虽然本品为抗生素类药物，但受抗菌谱范围的限制，如需多剂量使用，仍需选择恰当的抑菌剂，保证其在存贮和多次使用时不被微生物污染。对于11家处方中含有抑菌剂的企业产品，近半数企业因使用抑菌剂的浓度偏低而达不到相应的抑菌效力。个别企业虽达到抑菌效力标准“A”，但添加浓度明显高于常规水平。进一步检查11家企业抑菌剂含量，发现3家企业6批产品达不到处方标示量的80%~120%。这些产品使用了羟苯乙酯、三氯叔丁醇或硫柳汞为抑菌剂。经冻融实验考察，含较高浓度羟苯乙酯的产品在存贮温度过低时存在结晶析出的风险。实验结果还显示存放在低密度聚乙烯包装材料中的三氯叔丁醇和硫柳汞，随着时间的推移，其含量会明显降低，提示低密度聚乙烯包装材料对于三氯叔丁醇和硫柳汞可能存在吸附作用或者其他配伍禁忌。另外，实验证明三氯叔丁醇在pH超过5时，其稳定性及其抑菌效果明显下降，因此，以目前供试品的pH水平，不宜选择三氯叔丁醇作为抑菌剂。

综上所述，目前国产盐酸洛美沙星滴眼液抑菌剂的使用还存在一定的不合理性，尽管目前2015年版《中国药典》对于抑菌剂检测法的执行范围仅限于新药处方抑菌剂用量的筛选，但是为了提高企业自身产品质量，增强企业的市场竞争力，建议企业进一步优化产品处方工艺，在抑菌剂的选择问题上采取科学严谨的态度，本着最低有效的原则，结合滴眼液储藏和使用特点，统筹考虑抑菌作用、毒性作用、配伍关系、稳定性以及环境影响等多方面因素，尽可能做到以上条件的“完美”组合。