2018, Vol. 38 
2. 曲靖市第一人民医院, 曲靖 655000
2. The First People's Hospital of Qujing, Qujing 655000, China
老蔻丸由白豆蔻、砂仁、肉桂、丁香、当归、川芎、青皮、陈皮、大黄、木香、枳壳、厚朴等24味中药材组成，具有开郁舒气，温胃消食的功效[1]，临床上对消化性溃疡脾胃虚寒证具有显著疗效[2]。方中肉桂散寒止痛，温通经脉，主要含有挥发油、多糖、多酚、香豆素以及无机元素等化学成分，具有抗胃溃疡、抗炎、抗菌、抗肿瘤、预防糖尿病以及镇静、解痉、解热等药理作用[3]；丁香温中降逆，补肾助阳，主要含挥发油，包括丁香酚、乙酰丁香酚、β-丁香烯、水杨酸甲酯、苯甲醛等，而丁香酚是丁香挥发油的主要成分，具有抑制血小板聚集、抗氧化、抗衰老、清除活性氧自由基以及抗菌、抗炎等多种药理作用[4]；青皮疏肝破气，消积化滞，陈皮理气健脾，燥湿化痰，枳壳理气宽中、行滞消胀，青皮、陈皮以及枳壳都属于芸香科植物，主要含有黄酮类物质，目前研究表明，此类植物的黄酮成分具有抗癌、抗氧化、抗炎症、预防心血管疾病以及抗菌、抗病毒等作用[5]；大黄泄下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄，主要成分有蒽醌类、大黄多糖、大黄鞣质，现代临床研究表明其具有通利水谷，凉血解毒，主下瘀血，利湿退黄等功效[6]；厚朴燥湿消痰，下气除满，主要含酚、生物碱、挥发油等类成分，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎镇痛等作用[7]。由于该处方较为复杂，现行标准过于简单，不足以满足该品种的质量控制要求，而该品种含量测定相关报道[8]较少，报道的指标成分较为单一，仅体现在处方中大黄的大黄酚上。为使该品种的质量控制能更全面客观反映该品种的质量，本研究参照相关文献[9-19]，建立HPLC法同时测定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、桂皮醛、丁香酚、和厚朴酚、厚朴酚、大黄酚的含量，以控制处方中枳壳、青皮、陈皮、肉桂、丁香、大黄及厚朴的质量，从而为该品种质量标准的提升提供依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器岛津LC-20A高效液相色谱仪(CBM-20A系统控制器；LC-20AT泵；SIL-20A自动进样器；CTO-10ASvp柱温箱；SPD-20A检测器；LCsolution色谱工作站)。电子分析天平为METTLER TOLEDO MS205DU型电子天平(梅特勒—托利多国际股份有限公司)，BRAND移液器(普兰德(上海)贸易有限公司)，KQ-100VDB三频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 药品与试剂老蔻丸(内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司提供，批号22160404、22160406、22160504，规格：每袋装3.6 g)；对照品柚皮苷(批号110722-201613，含量为94.3%)、橙皮苷(批号110721-201617，含量为96.1%)、新橙皮苷(批号111857-201102，含量为99.6%)、和厚朴酚(批号110730-201313，含量为99.1%)、厚朴酚(批号110729-200412，含量为100.0%)、大黄酚(批号110796-201621，含量为99.2%)、丁香酚(批号110725-201615，含量为99.3%)、桂皮醛(批号110710-201720，含量为98.7%)均由中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用。甲醇、乙腈为色谱纯(均为默克公司)，水为二次蒸馏水。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱：依利特SinoChrom ODS-BP C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)-甲醇(C)，梯度洗脱(0~15 min，10%A→24%A；15~20 min，24%A→42%A；20~30 min，42%A→50%A；30~50 min，50%A→66%A；50~65 min，66%A→10%A；0~65 min，10%C)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；进样量：15 μL。
2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液精密称取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、桂皮醛、丁香酚、和厚朴酚、厚朴酚、大黄酚对照品适量，分别加甲醇制成含柚皮苷1 050.502 μg·mL-1、橙皮苷978.298 μg·mL-1、新橙皮苷1 248.984 μg·mL-1、桂皮醛130.185 μg·mL-1、丁香酚484.981 μg·mL-1、和厚朴酚1 196.137 μg·mL-1、厚朴酚1 039 μg·mL-1、大黄酚100.092 8 μg·mL-1的对照品储备液，再分别吸取上述储备液适量，加甲醇制成分别含柚皮苷200.015 6 μg·mL-1、橙皮苷201.021 0 μg·mL-1、新橙皮苷100.014 0 μg·mL-1、桂皮醛19.242 0 μg·mL-1、丁香酚32.043 0 μg·mL-1、和厚朴酚149.954 0 μg·mL-1、厚朴酚200.111 4 μg·mL-1、大黄酚8.007 0 μg·mL-1的混合对照品溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液取老蔻丸(批号22160404)适量，研细，取约1 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理(45 kHz，100 W)60 min，放冷，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。
2.2.3 阴性对照溶液按老蔻丸处方比例，分别制备缺青皮、陈皮、枳壳、肉桂、丁香、大黄、厚朴的阴性样品，取该阴性样品，按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。
2.3 专属性试验分别吸取供试品、对照品、阴性对照等溶液，按“2.1”项色谱条件测定，记录色谱图，详见图 1。结果表明，阴性对照溶液在混合对照色谱峰相应位置处无相应峰出现，供试品中主峰与其相邻色谱峰均能达到基线分离。
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1.柚皮苷(naringin) 2.橙皮苷(hesperidin) 3.新橙皮苷(neohesperidin) 4.桂皮醛(cinnamaldehyde) 5.丁香酚(eugenol) 6.和厚朴酚(honokiol) 7.厚朴酚(magnolol) 8.大黄酚(chrysophanol) A.混合对照品溶液(solution of mixed reference substances) B.供试品溶液(sample solution) C.缺青皮、陈皮、枳壳阴性溶液(negative sample solution without Citri Reticulatae Pericarpium Viride，Citri Reticulatae Pericarpium and Aurantii Fructus) D.缺肉桂阴性溶液(negative sample solution without Cinnamomi Cortex) E.缺丁香阴性溶液(negative sample solution without Caryophylli Flos) F.缺大黄阴性溶液(negative sample solution without Rhei Radix et Rhizoma) G.缺厚朴阴性溶液(negative sample solution without Magnoliae Officinalis Cortex) 图 1 高效液相色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms |
取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，用0.45 μm的微孔滤膜滤过。分别精密吸取滤液2、5、10、15、20、30 μL注入液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件测定，记录峰面积。以各组分质量浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表 1。结果表明，上述8种成分在各自范围内与各自的峰面积积分值呈良好的线性关系。
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表 1 8种成分线性关系 Table 1 Linear relationships of eight constituents |
精密吸取“2.2.1”项下用0.45 μm的微孔滤膜滤过的混合对照品溶液15 μL，按“2.1”项色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、桂皮醛、丁香酚、和厚朴酚、厚朴酚、大黄酚峰面积的RSD分别为0.044%、0.047%、0.062%、0.30%、1.2%、0.23%、0.17%、0.66%(n=6)。表明本方法精密度良好。
2.6 稳定性试验取“2.2.2”项下的供试品溶液，分别放置0、2、4、8、16、24、48 h时进样15μL，按“2.1”项色谱条件进样分析，记录峰面积。结果，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、桂皮醛、丁香酚、和厚朴酚、厚朴酚、大黄酚峰面积的RSD分别为0.073%、0.11%、0.13%、0.47%、1.24%、0.38%、0.28%、0.71%(n=6)。表明样品在48 h内稳定性良好。
2.7 重复性试验取样品(批号22160404)6份，分别按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.1”项色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，每1 g样品中平均含柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、桂皮醛、丁香酚、和厚朴酚、厚朴酚、大黄酚1 486.03、6 992.03、1 278.68、236.28、1 897.43、3 765.60、2 879.05、280.41μg，RSD分别为0.85%、0.78%、0.63%、0.87%、1.2%、0.48%、0.57%和0.31%(n=6)，表明本方法重复性良好。
2.8 加样回收率试验取样品(批号22160404)6份，每份约0.5 g，精密称定，置25 mL量瓶中，分别精密加入“2.2.1”下的标准储备液：柚皮苷、桂皮醛、丁香酚、和厚朴酚、厚朴酚1 mL；橙皮苷、新橙皮苷、大黄酚0.5 mL，再加入甲醇适量，按“2.2.2”项下方法超声处理制成供试品溶液，再在“2.1”项色谱条件下测定，计算回收率，结果见表 2。
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表 2 加样回收率试验结果(n=6) Table 2 Results of recovery tests |
取3批样品各1 g，精密称定，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以峰面积计算样品中各待测物质的含量，结果见表 3。
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表 3 样品含量测定结果(μg·g-1，n=3) Table 3 Results of content determination of samples |
文献[9]报道，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷在283 nm波长处有最大吸收，笔者对和厚朴酚、厚朴酚、桂皮醛、丁香酚进行紫外扫描发现，和厚朴酚、厚朴酚分别在293、292 nm波长处有最大吸收，桂皮醛、丁香酚分别在280、285 nm波长处有最大吸收。鉴于本处方中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚的含量较高，综合考虑，将柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、桂皮醛、丁香酚、和厚朴酚及厚朴酚的测定波长定为280 nm；《中华人民共和国药典》[20]将大黄酚测定波长定为254 nm，但由于检测时间较短，测定过程中频繁更换检测波长导致测定时基线不稳定，且大黄酚在254 nm波长处测定的响应值与在280 nm波长处的响应值差异不大，故最终将其测定波长定为280 nm。
3.2 提取方法选择本方法考察乙醇及甲醇作为提取溶剂，但在测定过程中以乙醇作为提取溶剂的样品峰形出现拖尾，甲醇为提取溶剂的样品峰形较好，理论板数均达到60 000以上，故选定甲醇作为提取溶剂。提取时间考察超声提取15、20、30、40、50、60、70 min时含量随时间的变化，发现随时间的推移，含量逐渐增加，在60 min与70 min的含量基本未改变，故选择甲醇超声提取60min。
3.3 流动相选择本方法在谢淑桐等[9]所使用相关方法的基础上，在流动相中加入适当比例的甲醇，采用梯度洗脱能使待测组分得到很好分离。
3.4 小结本方法的建立，可同时对该处方中的青皮、陈皮、枳壳、肉桂、丁香、大黄及厚朴进行质量控制，且提取方法简便、快速，流动相选择简单，测试结果重复性好，可为老蔻丸的标准提升提供依据。
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