2018, Vol. 38 
2. 江苏省食品药品监督检验研究院, 南京 210008
2. Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210008, China
西洋参为五加科植物西洋参（Panax quinque-folium L.）的干燥根，始载于《本草从新》，是我国传统名贵中药材。研究结果显示，人参皂苷Rg1、Re、Rb1等皂苷类成分是西洋参中主要活性物质，具有耐缺氧、抗衰老、抗肿瘤和提高机体免疫力等作用[1-3]，其质量分数占总皂苷的90%以上[4]。西洋参在疾病治疗领域及保健食品领域均有广泛应用。现在市场上以西洋参为原料的保健食品主要有含片、胶囊等剂型。从近年来对类保健食品的监督抽检和风险监测情况可知，市售西洋参产地众多，质量参差不齐[4-5]。因此，如何采取科学、有效的技术方法，测定西洋参类保健食品中人参皂苷类成分的含量至关重要。
目前，我国含西洋参类保健食品的质量控制方法主要有比色法[6]和高效液相色谱法[7]。比色法存在操作烦琐，专属性差，测定结果干扰因素多等缺陷；高效液相色谱法基本采用外标法测定，一般测人参皂苷Rg1、Re、Rb1等，并不能完全反映其质量优劣。因外标法需要的对照品种类较多，且有些对照品难以获得、价格昂贵，王智民等[8]在多指标质控模式中提出了“一测多评”法，即只测定1个成分，来实现多个成分的同步测定，目前已用于解决中药质量控制中缺乏对照品这一瓶颈问题[9-15]。但“一测多评”法在保健食品质量控制中的应用报道甚少，在含西洋参类保健食品中的应用未见报道。本文采用HPLC法，建立了以人参皂苷Rb1为参照物，同时测定人参皂苷Rg1、Re、Rg2、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd共9个成分的一测多评法，并考察了该方法的适用性和可行性，结果表明，该方法简便、准确，可为含西洋参类保健食品的质量控制提供技术方案。
1 仪器与试药 1.1 仪器Shimadzu LC-30A型高效液相色谱仪；Agilent Series 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：Agilent ZOBAX SB-Aq C18（4.6 mm×250 mm，5 um；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）；Sartorius MSE224S电子天平（德国赛多利斯公司）；METTLER XP6电子天平（瑞士梅特勒公司）；KH-250DB型数控超声波清洗器（江苏昆山市禾创超声仪器有限公司）；高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）。
1.2 试药人参皂苷Rg1（纯度98.2%，批号A3390050）、Rc（纯度为99.2%，批号D3030025）购自上海安谱实验科技股份有限公司；人参皂苷Re（纯度为97.4%，批号110751-201626）、Rb1（纯度为95.0%，批号110704-201625）、Rb2（纯度为93.8%，批号111715-201203）、Rb3（纯度为97.0%，批号111686-201504）、Rd（纯度为92.1%，批号111818-201603）购自中国食品药品检定研究院；人参皂苷Rg2（纯度98.0%，批号M17M8S31526）、Ro（纯度98.0%，批号P15A6F2403）购自上海源叶生物科技有限公司。
乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
收集10批不同来源的市售含西洋参保健食品（见表 1），其剂型涉及含片、胶囊，方法学验证采用样7作为研究对象。
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表 1 样品来源及批号 Table 1 The source and batch of samples |
精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rg2、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的对照品各适量，分别用甲醇制成对照品储备液，浓度均约为2 mg·mL-1；再以此储备液稀释配制成4、10、20、40、100、200，800 μg·mL-1的系列混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液取胶囊10粒的内容物研细、混匀（取含片10片，研细、混匀），各取约1.0 g，精密称定，精密加入水饱和正丁醇25 mL，称定重量，超声（250 W，40 kHz）处理30 min，放冷，再称定重量，用水饱和正丁醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，65 ℃水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，定量转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，离心（6 000 r·min-1，5 min），滤过（0.45 µm），取续滤液，即得。
2.2 色谱条件色谱柱：Agilent ZOBAX SB-Aq C18（4.6 mm×250 mm，5 um）；流动相0.005%甲酸水溶液（A）-0.005%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱（0~20 min，79%A；20~49 min，79%A→66%A；49~65 min，66%A→60%A），流速1.0 mL·min-1；检测波长203 nm；柱温为30 ℃；进样量10 μL。在上述色谱条件下，各待测组分峰分离度均大于1.5。见图 1。
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1.人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）2.人参皂苷Re（ginsenoside Re）3.人参皂苷Rg2（ginsenoside Rg2）4.人参皂苷Ro（ginsenoside Ro）5.人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb1）6.人参皂苷Rc（ginsenoside Rc）7.人参皂苷Rb2（ginsenoside Rb2）8.人参皂苷Rb3（ginsenoside Rb3）9.人参皂苷Rd（ginsenoside Rd） 图 1 对照品（A）及样品（B）色谱图 Figure 1 Chromatograms of reference substances(A)and sample(B) |
按照“2.2”项下的色谱条件测定“2.1.1”项下的混合对照品溶液，记录人参皂苷Rg1、Re、Rg2、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3及Rd的色谱峰面积，以峰面积值为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归，以信噪比S/N≥3和S/N≥10时作为各化合物的检测下限和定量下限，结果见表 2。
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表 2 9个成分线性范围、回归方程和相关系数 Table 2 Linearity range, regression equation and correlation coefficient of 9 components |
精密吸取“2.1.1”项下的同一混合对照品溶液，按前述色谱条件重复进样6次测定。结果人参皂苷Rg1、Re、Rg2、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的RSD分别为1.3%、1.6%、1.1%、0.60%、0.80%、0.10%、0.30%、0.40%、0.40%，表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验取制备好的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24、36 h进样测定，记录各化合物的峰面积，结果人参皂苷Rg1、Re、Rg2、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd峰面积的RSD分别为1.0%、1.5%、1.3%、1.5%、0.6%、1.6%、1.1%、0.8%、1.2%，表明供试品溶液能够在36 h内保持稳定。
2.3.4 重复性试验取样7内容物6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在相同的色谱条件下进行测定并计算含量，结果人参皂苷Rg1、Re、Rg2、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的含量分别为0.53、2.22、0.08、0.38、6.98、1.55、0.22、0.34、1.47 mg·g-1，其RSD分别为1.1%、1.6%、1.7%、1.5%、0.90%、1.2%、0.90%、1.2%、1.5%，表明本方法重复性较好。
2.3.5 加样回收率试验取已测定各皂苷含量的样品7内容物适量，研细，混匀，取约0.5 g，精密称定，平行6份，分别精密加入混合对照品溶液（含人参皂苷Rg1 0.277 0 mg·mL-1、人参皂苷Re 1.020 mg·mL-1、人参皂苷Rg2 0.041 0 mg·mL-1、人参皂苷Ro 0.203 0 mg·mL-1、人参皂苷Rc 0.742 0 mg·mL-1、人参皂苷Rb2 0.108 0 mg·mL-1、人参皂苷Rb3 0.153 0 mg·mL- 1及人参皂苷Rd 0.772 5 mg·mL-1）各1 mL，对照品溶液（人参皂苷Rb1 1.498 7 mg·mL-1）2 mL，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，并分别计算其平均回收率。结果人参皂苷Rg1、Re、Rg2、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的平均回收率分别为101.1%、101.9%、100.3%、99.9%、105.9%、104.4%、102.6%、100.5%、96.2%，RSD分别为1.2%、2.7%、1.4%、2.1%、2.1%、1.9%、2.1%、3.0%、1.1%，结果表明分析方法准确高。
2.3.6 一测多评方法确定 2.3.6.1 相对校正因子的计算采用多点校正法，即以多个浓度点计算所得的相对校正因子（fn/s），取平均值作为定量用fn/s，其计算公式为fn/s=（Cs×An）×（Cn×As），式中fn/s为相对校正因子；Cs为参照物浓度；As为参照物峰面积；Cn为其他对照组分浓度；An为其他对照组分峰面积。本文是以人参皂苷Rb1为参照物计算西洋参保健食品中各待测成分的fn/s，结果见表 3。
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表 3 皂苷类成分的fn/s Table 3 fn/s of saponins |
取“2.1.1”项下的混合对照品溶液，选定Shimadzu LC-30A型和Agilent Series 1260型高效液相色谱仪，分别用Agilent Zorbax SB-Aq C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱进行色谱分析，记录峰面积，计算fn/s；所得结果见表 4。结果表明，不同高效液相色谱仪和不同色谱柱对本文分析的人参皂苷类成分的RSD均小于5%。
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表 4 不同高效液相色谱仪及色谱柱的fn/s Table 4 fn/s determined by different high performance liquid chromatographs and columns |
在其他色谱条件不变的情况下，分别设定流速为0.9、1.0、1.1 mL·min-1，取“2.1.1”项下的混合对照品溶液进样测定，记录峰面积，计算fn/s，结果人参皂苷Rg1、Re、Rg2、Ro、Rc、Rb2、Rb3、Rd的RSD分别为0.50%、2.8%、1.1%、2.3%、1.7%、3.1%、3.1%、0.4%，表明流速对各成分fn/s的影响没有显著性差异。
2.3.6.4 不同柱温的考察在其他色谱条件不变的情况下，分别设定柱温为25、30、35 ℃，取“2.1.1”项下的混合对照品溶液进样测定，记录峰面积，计算fn/s，结果人参皂苷Rg1、Re、Rg2、Ro、Rc、Rb2、Rb3、Rd的RSD分别为3.7%、4.6%、1.8%、1.3%、2.2%、1.7%、2.3%、1.5%，表明柱温对各成分fn/s的影响没有显著性差异。
2.3.6.5 一测多评法待测成分色谱峰的定位本文以人参皂苷Rb1为内参物，以保留时间差和相对保留时间值为定位标准进行考察。分别采用不同的高效液相色谱仪和色谱柱进行定位考察。结果发现，相对保留值波动较小，RSD除人参皂苷Rg1，Re外均小于3%（对这2个成分稍作定位），无显著性差异。如表 5所示，因此，本文选择相对保留时间值作为最终定位标准。
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表 5 不同仪器和色谱柱相对保留值比较 Table 5 Relative retention time determined by different instruments and columns |
采用外标法测定样品中9个人参皂苷含量，再用相对偏差评价其与一测多评法的计算值，结果各成分含量无显著差异，相对偏差 < 5%，见表 6。
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表 6 不同方法对西洋参保健品中9个成分含量测定结果（mg·g-1，n=3） Table 6 Determination results of 9 components in health foods containing American ginseng by different methods |
本研究通过对“一测多评”法与外标法的测定结果进行相对偏差评价，结果显示两者无显著性差异，且样品中人参皂苷类成分的含量越高，两者差异越小。
通过对10批样品中皂苷总量（9个人参皂苷含量之和）的PLS-DA分析（结果见图 2）发现含片和胶囊2种剂型在皂苷总量上有明显的差异，并且一测多评测定的结果也显示3批胶囊的总皂苷含量明显高于7批含片。可能原因是制备生产工艺造成的；样品2中皂苷总量最低，且未检测到人参皂苷Rg1和Re，可能是劣质西洋参投料或采用经提取过的西洋参投料；样品所含9个皂苷成分类的量各不相同，人参皂苷Rb1和Re两者之和超过了总皂苷的50%，其余7个皂苷类含量相对较低；单个皂苷占总皂苷的比例在不同批次间各不相同，故同时测定多个人参皂苷类成分的含量较仅测定1、2个皂苷类成分含量能更好地控制该类产品的质量。
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图 2 10批样品的PLS-DA Figure 2 PLS-DA plots of 10 batches of samples |
人参皂苷Rb1在各类样品中含量均较高，且保留时间适中；同时人参皂苷Rb1对照品化学性质稳定，易于得到，故选其作为“一测多评”法的内参物。
本实验考察了不同品牌的色谱柱及仪器，发现9个皂苷类成分中有2个成分出峰顺序有所变化。若控制7个皂苷类成分，对色谱柱的选择有很大的自由度；若控制9个皂苷类成分，则必须明确色谱柱厂牌、长度、粒径等参数，才能保证既定色谱条件下相对保留时间在一定范围内保持稳定。最终选取2种高效液相色谱仪和2根相同品牌色谱柱，分别考察保留时间差和相对保留时间的可靠性，结果相对保留时间能实现更准确的峰定位。因人参皂苷Rg1和Re的对照品较易得到，故建议对这2个成分采用对照品定位，其他成分用相对保留时间定位。另外，对RCF进行考察，分别考察了不同流速、不同柱温、不同仪器、不同色谱柱对fn/s的影响，结果显示RSD均小于5%，测定结果无显著性差异。
本研究针对含西洋参类保健食品中的人参皂苷类成分进行定量分析，对“一测多评”的技术适用性和实践可行性进行了探讨。结果表明，“一测多评”法具有快速、简便、低成本等优点，可有效解决大量分离纯化难度较高的化学对照品稀缺以及价格昂贵的问题，并应用于西洋参保健品质量评价体系中，为西洋参保健品质量标准的研究提供理论依据和数据支撑。
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