2018, Vol. 38 
2. 内蒙古蒙医药工程技术研究院, 通辽 028000
2. Inner Mongolia Engineering Technology Institute of Traditional Mongolia Medicine, Tongliao 028000, China
黄花黄芩，又名粘毛黄芩，蒙语名希日-混芩、希日-巴布，系唇形科黄芩属植物粘毛黄芩Scutellaria viscidula Bge.的干燥根，有清热、解毒之功效，用于毒热症[1]，主要分布于我国的内蒙古、山西北部、河北北部等地[2]。查阅蒙医药相关历代文献得知，所记载的希日-巴布为黄花黄芩，蒙医临床所用黄芩的正品为黄花黄芩。黄花黄芩记载于经典蒙医药著作[3-6]《蒙药正典》、《晶珠本草》、《金光注释集》和《医宗要旨》中，现有标准《内蒙古蒙药材标准》[7]（1986年版），其性状、来源和功能主治与经典著作描述基本一致，但现有标准无鉴别、检查和含量测定项，因此，提升黄花黄芩质量控制方法，保证临床用药安全的意义重大。本文建立了黄花黄芩的薄层色谱鉴别和含量测定HPLC法，并对黄花黄芩进行了水分、灰分和浸出物等的测定，所建立的方法快速简便，准确可靠，可行性高，为其质量标准提升提供依据。
1 仪器与材料 1.1 仪器岛津LC-20AT型高效液相色谱仪（LC-20AT泵、SPDD-20A检测器、CTO-20A控制器）；Milli-Q超纯水机；KQ-600DB型数控超声波清洗机；MS105型分析天平；SOP型电子天平；YP1201N电子天平。
1.2 材料甲醇为色谱级（天津星马克科技发展有限公司）；乙醇、磷酸、乙酸乙酯、甲酸均为分析纯（天津市永大化学试剂有限公司）；甲苯为分析纯（天津市大茂化学试剂厂）；聚酰胺薄膜（薄层层析用），天津思利达科技有限公司；聚酰胺薄膜（薄层层析用），浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂；汉黄芩素（批号2887）、黄芩素（批号3634）、黄芩苷（批号4663、4158）的对照品，纯度≥98.0%，均购于上海诗丹得标准服务有限公司。7批次黄花黄芩，由内蒙古自治区食品药品检验所原蒙药室主任康双龙、内蒙古农业大学林学院教授额日敦·嘎日迪、内蒙古民族大学蒙医药学院教授布和巴特尔、内蒙古民族大学蒙医药学院教授吴香杰、内蒙古蒙医药工程技术研究院特聘专家白明刚和通辽市食品药品检验所中蒙药室主任安文源鉴定，均为唇形科植物粘毛黄芩Scutellaria viscidula Bge.的干燥根。样品采集信息见表 1。
|
表 1 黄花黄芩样品采集信息 Table 1 Sample collection information |
取本品中粉2 g，加乙酸乙酯-甲醇（3:1）30 mL，加热回流30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，取上清液作为供试品溶液。
2.1.2 对照品溶液的制备取黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素的对照品适量，加甲醇分别制成1 mL各含1 mg的溶液，作为对照品溶液。
2.1.3 薄层色谱鉴别照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2015年版薄层色谱法试验[8]，吸取上述供试品溶液2 μL及上述3种对照品溶液各1 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10:3:1:2）。将不同产地7批次黄花黄芩药材进行薄层色谱鉴别，结果见图 1。结果表明，展开系统的供试品色谱中，在与对照药品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；斑点Rf值适宜，显色清晰，色谱分离好，且信息量多。
|
1.汉黄芩素（wogonin）2.黄芩素（baicalein）3.黄芩苷（baicalin）N1~N7.药材（medicinal herbs） 图 1 不同产地7批次黄花黄芩薄层色谱鉴别图 Figure 1 TLC chromatograms of 7 batches of Scutellariae Viscidulae Radix from different habitats |
照《中国药典》2015年版四部通则0832水分测定法第二法[8]，对7批药材的水分进行考察。结果7批黄花黄芩水分为5.62%~6.65%，平均值为6.14%。
2.2.2 灰分测定法、酸不溶性灰分照《中国药典》2015年版四部通则2302灰分测定法[8]，对7批药材总灰分进行测定。结果7批黄花黄芩总灰分为2.47%~4.31%，平均值为3.59%，酸不溶性灰分为0.33%~0.59%，平均值为0.44%。
2.2.3 砷盐检查对本品中的砷盐含量进行限量考察。参照《中国药典》2005年版一部阿胶砷盐检查法[9]，取样品2.50 g，置100 mL定氮瓶中，加氢氧化钙1 g，混合，加少量水，搅匀，干燥后先用小火烧灼使碳化，再在500~600 ℃炽灼使完全灰化，放冷，加盐酸3 mL与适量的水使溶解成25 mL，即得已消化液；精密量取已消化液10 mL，置100 mL标准磨口锥形瓶中，加盐酸4 mL与水14 mL，照《中国药典》2015年版四部通则0822砷盐检查法第一法标准砷对照液的制备[8]，自“再加碘化钾试液5 mL”起，依法操作。结果7批次样品中，每1 g内容物中的砷盐含量均少于2 μg，即都低于2%。
2.2.4 重金属检查对本品中的重金属含量进行限量考察。参照《中国药典》2005年版一部阿胶砷盐检查法[9]，取本品内容物1.00 g，照《中国药典》2015年版四部通则0821重金属检查法第二法依法操作检查[8]。结果每批样品每1 g内容物中的重金属含量均少于10 μg，即都低于0.001%。
2.3 浸出物参考《中国药典》2015版一部中黄芩的浸出物测定，照醇溶性浸出物测定法（《中国药典》2015年版四部通则2201）项下的热浸法测定[8]，用70%乙醇作为溶剂，结果7批黄花黄芩浸出物为44.10%~48.28%。
2.4 含量测定照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版四部）通则0512）测定[8]。
2.4.1 色谱条件与耐用性试验色谱柱为Waters HHS T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液（47:53）；流速1 mL·min-1；柱温40 ℃；检测波长280 nm。理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于2 500，分离色谱图见图 2。
|
1.黄芩苷（baicalin） A.样品（sample）B.对照品（reference substance） 图 2 高效液相色谱图 Figure 2 HPLC chromatograms |
精密吸取同一供试品溶液10 μL，用装置不同品牌C18色谱柱的液相色谱仪测定，进行比较分析。结果见表 2，表明采用不同品牌C18色谱柱测定本品中黄芩苷含量的结果没有明显差异，表明色谱柱耐用性较好。
|
|
表 2 不同品牌色谱柱耐用性试验结果（n=3） Table 2 The test results of durability on different brands of chromatographic columns |
取在60 ℃减压干燥4 h的黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含1.032 mg的溶液，即得。
2.4.3 供试品溶液的制备取本品中粉约0.3 g，精密称定，加70 %乙醇40 mL，加热回流3 h，放冷，滤过，滤液置100 mL量瓶中，用少量70 %乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得。
2.4.4 线性关系考察精密吸取“2.4.2”项下对照品溶液0.1、0.3、0.7、1.0 mL，分别置10 mL量瓶内，加甲醇至刻度，得到4个不同浓度的对照品溶液，各进样10 μL，按照上述色谱条件测定峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：
Y=40 359X+34 874 r=0.999 7
结果黄芩苷质量浓度在10.32~103.2 μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.4.5 精密度试验取同一浓度的黄芩苷对照品溶液，在24 h内连续进样6次，测定黄芩苷的峰面积，计算峰面积的RSD为1.3%。结果表明日内精密度良好。
2.4.6 稳定性试验取样品N1（批号NMHQ-01-001），按照“2.4.3”项下方法制备供试品溶液。分别在0、2、4、6、8、12、24、48 h进样10 μL，记录黄芩苷峰面积，计算黄芩苷的RSD为0.17%，表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.4.7 重复性试验取样品N1（批号NMHQ-01-001），按照“2.4.3”项下的方法制备供试品溶液6份，进样10 μL，记录黄芩苷的峰面积，计算含量，结果分别为8.71%、8.45%、8.40%、8.29%、8.24%、8.51%，RSD为2.0%，表明方法重复性良好。
2.4.8 加样回收率试验取已知含量的样品N1（批号NMHQ-01-001）约0.15 g，9份，精密称定，分别置圆底烧瓶中，按高、中、低浓度对照品加入量与所取供试品中待测成分量之比控制在0.5:1、1:1、1.5:1左右，按照“2.4.3”项下的方法制备供试溶液。各精密吸取10 μL，分别注入液相色谱仪，每份测定3次，并计算加样回收率。结果见表 3。
|
|
表 3 黄芩苷加样回收率结果（n=3） Table 3 The results of recovery |
回收率试验结果符合药品质量标准分析方法验证指导原则（《中国药典》2015年版四部通则9101）规定（待测定成分含量1 %，回收率限度92%~105%）。表明本试验所采用的测定方法结果准确、可靠，可用于样品测定。
2.4.9 7批次样品的含量测定取样品中粉（过4号筛）约0.3 g，按照“2.4.3”项下方法制备供试品溶液；精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，每份测定3次，并采用标准曲线法计算样品中黄芩苷的含量。结果见表 4。
|
|
表 4 7批黄花黄芩样品中黄芩苷的含量测定结果（n=3） Table 4 The determination results of baicalin in 7 batches of Scutellariae Viscidulae Radix |
黄花黄芩是蒙医临床用特色蒙药材。通过文献查阅[10-16]，黄花黄芩的化学成分主要有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、穿心莲黄酮、黄芩新素、千层质素A、粘毛黄芩素Ⅰ、粘毛黄芩素Ⅱ、粘毛黄芩素Ⅲ等，参考《中国药典》2015年版黄芩药材项下的对照品[17]，选择黄芩苷为黄花黄芩含量测定指标，选择黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素为黄花黄芩薄层色谱鉴别的指标性成分。
含量测定结果表明，黄花黄芩7批样品按干燥品计算，黄芩苷的平均含量约为10.07%，各批含量离散程度较大，在5.6%~12.5%之间。《中国药典》2015年版一部规定，黄芩按干燥品计，含黄芩苷（C21H18O11）不得少于9.0%。综合分析结果，考虑产地、采集、加工、贮运及季节气候等影响因素，根据黄花黄芩7批样品中含黄芩苷的平均值（10.1±20）%计，取下限，即8.1%，暂定本品按干燥品计算，含黄芩苷（C21H18O11）不得少于8.0%。
基于黄花黄芩的化学成分研究基础及定性、定量分析，提升了黄花黄芩的质量控制方法，涉及性状、检查（水分、灰分），以黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素为指标的薄层色谱鉴别方法和以黄芩苷为指标的HPLC含量测定方法。系统的方法验证和第三方的复核结果表明，建立的方法合理，重复性好，标准可行，能够用于黄花黄芩的质量控制。
| [1] |
国家中医药管理局中华本草编委会. 中华本草.蒙药卷[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2004: 306. China Materia Medica Editorial Board of the State Administration of Traditional Chinese Medicine. Chinese Materia Medica.Mongolian Medicine Roll[M]. Shanghai: Shanghai Science and Technology Publishers, 2004: 306. |
| [2] |
中国植物志编委员会. 中国植物志.第65卷.第2册[M]. 北京: 科学出版, 2004: 198.
|
| [3] |
占布拉道尔吉. 蒙药正典[M]. 赤峰: 内蒙古科学技术出版社, 2015: 204. ZHAN-BU-LA-DAO-ER-JI. Mengyao Zhengdian[M]. Chifeng: Inner Mongolia Science And Technology Press, 2015: 204. |
| [4] |
丹增彭措. 晶珠本草[M]. 赤峰: 内蒙古科学技术出版社, 2015: 341. DAN-ZENG-PENG-CUO. Jingzhu Bencao[M]. Chifeng: Inner Mongolia Science and Technology Press, 2015: 341. |
| [5] |
达日茂玛仁巴·罗布桑朝日嘎. 金光注释集[M]. 赤峰: 内蒙古科学技术出版社, 2015: 820. DA-RI-MAO-MA-REN-BA·LUO-BU-SANG-CHAO-RI-GA. Jinguang Zhushiji[M]. Chifeng: Inner Mongolia Science and Technology Press, 2015: 820. |
| [6] |
内蒙古自治区蒙医研究所编译. 医宗要旨[M]. 赤峰: 内蒙古科学技术出版社, 2015: 650. The Inner Mongolia Autonomous Region Mongolian Medical Research Institute Compile. Yizong Yaozhi[M]. Chifeng: Inner Mongolia Science and Technology Press, 2015: 650. |
| [7] |
内蒙古蒙药材标准[S].1986: 474 Inner Mongolia Mongolian Medicine Standard[S].1986: 474 |
| [8] |
中华人民共和国药典2015年版.四部[S].2015: 57, 103, 202, 204 ChP 2015.VolⅣ[S].2015: 57, 103, 202, 204 |
| [9] |
中华人民共和国药典2005年版.一部[S].2005: 130 ChP 2005.VolⅠ[S].2005: 130 |
| [10] |
于留荣, 刘美兰, 汪孝涛. 粘毛黄芩黄酮类成分的研究[J]. 药学学报, 1984, 19(5): 397. YU LR, LIU ML, WANG XT. Studies on of the flovonoids of Scutellalia viscidula Bunge[J]. Acta Pharm Sin, 1984, 19(5): 397. |
| [11] |
王红燕, 肖丽和, 刘丽, 等. 粘毛黄芩根的化学成分研究[J]. 沈阳药科大学学报, 2003, 20(5): 339. WANG HY, XIAO LH, LIU L, et al. Studies on chemical constituents of the roots of Scutellaria viscidula Bge[J]. J Shenyang Pharm Univ, 2003, 20(5): 339. DOI:10.3969/j.issn.1006-2858.2003.05.008 |
| [12] |
郭玲, 雷成康, 杨范莉, 等. 基于HPLC法的黄芩和粘毛黄芩药用化学成分相似性、多样性评价[J]. 西北药学杂志, 2016, 31(2): 115. GUO L, LEI CK, YANG FL, et al. Similarity and diversity evaluation of bioactive ingredients in S.baicalensis and S.viscidula by HPLC[J]. Northwest Pharm J, 2016, 31(2): 115. DOI:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.002 |
| [13] |
张金华, 李占军, 布仁, 等. 高效液相色谱法测定蒙药粘毛黄芩中黄芩苷的含量[J]. 时珍国医国药, 2008, 19(3): 558. ZHANG JH, LI ZJ, BU R, et al. Content determination of baicalin in the roots of Scutellaria viscidula Bge.by HPLC[J]. Lishizhen Med Mater Med Res, 2008, 19(3): 558. DOI:10.3969/j.issn.1008-0805.2008.03.021 |
| [14] |
杨宝喜. 蒙药材黄花黄芩历史沿革及现代研究概况[J]. 亚太传统医药, 2017, 13(16): 24. YANG BX. Review on changes in history and modern research of Scutellariae Viscidulae Radix[J]. Asia Pac Tradit Med, 2017, 13(16): 24. |
| [15] |
王淑芬, 孙一铭, 雷桅, 等. 粘毛黄芩毛状根培养体系的建立及其黄芩苷的动态合成[J]. 中国中药杂志, 2008, 33(14): 1669. WANG SF, SUN YM, LEI W, et al. Induction and culture of hairy roots in Scutellaria viscudula and its baicalin production[J]. China J Chin Mater Med, 2008, 33(14): 1669. |
| [16] |
乌仁曹布道, 聂波, 图雅. 黄花黄芩不同提取物的红外光谱研究[J]. 中国民族民间医药, 2017, 26(5): 10. WU-REN-CAO-BU-DAO, NIE B, TU-YA. The study of IR spectrum about the different extracts of Scutellaria viscidula Bunge[J]. Chin J Ethnomed Ethnopharm, 2017, 26(5): 10. |
| [17] |
中华人民共和国药典2015年版.一部[S].2015: 301 ChP 2015.VolⅠ[S].2015: 301 |