2018, Vol. 38 
白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是调节免疫反应和炎症反应的一种多效性细胞因子，与IL-6受体（IL-6R）结合后，可诱导软骨细胞和滑膜细胞产生基质金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-3和MMP-13[1]，还可通过诱导表达RANKL，从而促进破骨细胞的破骨作用，造成软骨的损伤[2]，在类风湿性关节炎患者的关节骨和软骨组织破坏方面显示出强大的作用。托珠（tocilizumab）是一种具有IL-6R抑制剂活性的治疗性单克隆抗体，通过与IL-6竞争结合位点而抑制IL-6向胞内转导信号，阻断IL-6的生物学活性，从而起到治疗类风湿性关节炎的作用[3]。随着近年来CAR-T细胞免疫治疗的兴起，托珠还被用于对抗因治疗后IL-6过量释放而引发的细胞因子风暴（cytokine storm）[4-6]。
目前，托珠的生物学活性测定方法主要以IL-6生长依赖细胞KT-3为基础[7]，通过对托珠处理后的KT-3细胞的生长抑制情况的评价进而测定托珠的相对生物学活性。但KT-3细胞为悬浮细胞，且其生长依赖特定的细胞因子，培养要求高，实际操作中失败机率较大，加之该方法耗时长，更增加了实验的时间和人力成本。
IL-6可经1条直接通道Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信号的转录子和活化子（signal transclucers and activators of transcription，STAT）途径，将信号从细胞表面受体转导至核，调控基因的转录，这一过程主要包括胞浆JAK、STAT先后磷酸化，sis诱导因子（sis-inducing factor，SIF）复合物的形成、核转位及与c-fos启动区sis诱导元素（sis-inducible element，SIE）的结合[8]，其中SIF复合物与SIE的结合是IL-6信号通路的关键环节。本研究拟建立一种能够稳定表达SIE-荧光素酶报告基因的细胞株，通过检测该细胞株在外源IL-6刺激下的荧光素酶活性即可测定托珠的相对生物学活性。
1 材料 1.1 细胞293T细胞购自中国科学院上海细胞库，由上海食品药品检验所生化药品生物制品室建库保存。
1.2 质粒含有SIE启动子区及Luciferase荧光素酶编码基因的质粒pGL 4.47购自美国Promega公司。
1.3 主要试剂及仪器阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；DMEM培养基及胎牛血清（FBS）均购自美国Gibco公司；潮霉素B（Hygromycin B）购自美国Thermo Fisher公司；人重组白介素6（hrIL-6）购自美国Sigma公司；荧光素酶底物Steady-Glo购自美国Promega公司；托珠单抗注射液（批号B2050B06）及托珠单抗注射液参比品（批号11759）均由瑞士罗氏公司提供；Spectra M5多功能酶标仪购自美国Molecular DevECes公司。
2 方法与结果 2.1 稳转细胞株的构建取对数生长期的293T细胞，转染前1天将细胞接种于6孔板，每孔1×106个细胞，24 h内待细胞融合度达到70%~90%，吸尽培养上清，加入无血清DMEM培养基1.5 mL，即得细胞培养液。另取2支1.5 mL EP管，分别加入无血清DMEM培养液0.25 mL，然后在其中1支EP管中加入pGL4.47质粒2 μL，另1支EP管中加入lipofectamine 2000阳离子质脂体5 μL，室温孵育10 min后将2支EP管中的液体混匀，继续室温孵育15 min。将0.5 mL孵育后的混合溶液缓慢加入细胞培养液中，温和混匀，即完成转染操作，转染后细胞置于培养箱常规培养。质粒转染后48 h，加入含有0.4 mg·m L-1潮霉素B的DMEM培养液，继续培养，根据细胞死亡情况和培养基的营养及时换液。以未转染的细胞作为对照，待对照细胞全部死亡后，消化转染组存活细胞，制备成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔理论上为1个细胞，加入含有0.4 mg·m L-1潮霉素B的DMEM培养液，继续培养；挑选生长状态良好的单细胞克隆依次全量转入24孔板、6孔板、75 mm2细胞培养瓶，用含有0.4 mg·m L-1潮霉素B的DMEM培养液进行连续扩大培养至少3代，得到一系列稳定表达由SIE所调控的荧光素酶的人肾上皮细胞株293T-SIE细胞克隆。
2.2 荧光素酶报告基因活性验证分别取不同的293T-SIE细胞克隆，按常规方法消化并计数[9]，根据计数结果将细胞悬液稀释至6×105个·m L-1，以每孔50 μL加入96孔白板中，共接种6个孔。其中3个孔加入无血清DMEM培养基50 μL，作为对照组，另3个孔加入hrIL-6工作液（取hrIL-6粉末100 μg，加入1 mL无菌水溶解，得到hrIL-6储存液。取hrIL-6储存液，用无血清DMEM培养基稀释至500 ng·m L-1，即得）50 μL，作为实验组，混匀后常规培养。培养6 h后取出白板，向每孔中加入荧光素酶底物100 μL，混匀后室温振荡5 min。使用多功能酶标仪，以每孔0.5 s的速度读取各孔的相对光单位（relative light unit，RLU），并计算实验组与对照组RLU平均值的比值。结果如图 1所示，编号为T12的细胞克隆具有显著的荧光素酶报告基因活性。
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图 1 不同293T-SIE细胞单克隆的荧光素酶活性鉴定结果（n=3） Figure 1 Identification results of luciferase activity of different 293T-SIE cell monoclonal |
分别对细胞接种密度及IL-6刺激浓度进行优化。取处于对数生长期的293T-SIE细胞用0.25%胰酶消化，1 000 r·min-1离心2 min，弃上清，将细胞重悬于细胞培养液（含10%FBS的无酚红DMEM培养基）中，计数。分别将细胞悬液稀释至0.8×106、0.4×106、0.2×106个·m L-1，以每孔50 μL接种于96孔白板。取hrIL-6储存液适量，用无酚红DMEM培养基分别稀释至2 000、400、80、16、3.2、0.61、0.13 ng·m L-1，得到IL-6梯度溶液。将IL-6梯度溶液加入上述细胞培养板中，每孔50 μL，每个实验组均设置3个平行复孔，将细胞培养板置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养6 h后，按“2.2”项中所述加入荧光素酶底物，室温振荡5 min，读取RLU。结果如图 2所示，当每孔细胞数量为4×104个时，对不同浓度的hrIL-6响应强度普遍优于其他细胞接种密度，同时在该接种密度下，当hrIL-6溶液的刺激浓度为100 ng·μ L-1时，发光信号达到次饱和，据此确定优化后的细胞接种密度为每孔4×104个，hrIL-6刺激质量浓度为100 ng·μ L-1。
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细胞密度（cell density）：Sample 1，4×104 cells per well；Sample 2，2×104 cells per well；Sample 3：1×104 cells per well 图 2 荧光素酶报告基因法测定生物学活性的条件优化结果图（n=3） Figure 2 Optimization of results for the determination of biological activity by luciferase reporter gene assay |
取处于对数生长期的293T-SIE细胞以0.8×106个·m L-1的浓度，接种于96孔白板，每孔50 μL。取hrIL-6储存液，用不含血清的无酚红DMEM培养基稀释至200 ng·m L-1，得到hrIL-6工作液。取托珠参比品，用不含血清的无酚红DMEM培养基稀释至200 μg·m L-1，然后3倍倍比稀释9个浓度，得到参比品溶液。取托珠单抗注射液待测样品，用不含血清的无酚红DMEM培养基稀释至200 μg·m L-1，然后3倍倍比稀释9个浓度，得到待测样品溶液。将上述不同浓度的参比品溶液与待测样品溶液，按每孔25 μL加至已接种细胞的96孔白板中。将hrIL-6工作液加入上述细胞培养板中，每孔25 μL。另设阴性对照与空白对照：两者均不加参比品或待测样品溶液，且阴性对照孔每孔加hrIL-6稀释液（取200 ng·m L-1 hrIL-6工作液，用不含血清的无酚红DMEM培养基稀释至100 ng·m L-1，即得）50 μL，空白对照孔每孔加不含血清的无酚红DMEM培养基50 μL。每个实验组均设置3个平行复孔，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养6 h。向每孔中加入荧光素酶底物100 μL，混匀后室温振荡5 min。使用多功能酶标仪，以每孔0.5 s的速度读取各孔的RLU。以参比品或待测样品的浓度的对数值为横坐标，各样品孔的RLU与空白对照RLU的平均值之差为纵坐标，分别绘制参比品与待测样品的量效曲线。通过软件GraphPadPrism 5.0非线性拟合中的Dose-response-Stimulaiton模式下的log[agonist] vs.response-variable slope进行数据回归分析。当参比品和待测样品的拟合曲线平行性假设得到确认（P > 0.05）时，使用constrained的曲线最大值、最小值、斜率，计算参比品和待测样品的半效量浓度EC50，按参比品EC50/待测样品EC50×100%计算待测样品相对生物学活性。结果显示，参比品和待测样品的拟合曲线平行性假设得到确认（P=0.98），经constrained变形（图 3），计算得EC50，参比品EC50为0.927 2 μg·m L-1，待测样品的EC50为0.982 5 μg·m L-1，按参比品EC50/待测样品EC50×100%计算得待测样品的相对生物学活性为94.37%。同批次样品经现行的KT-3细胞生长抑制法测定相对生物学活性，结果为102.27%，2种方法结果接近。
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图 3 报告基因法测定托珠注射液相对生物学活性结果图 Figure 3 Luciferase reporter gene assay for determining the relative biological activity of tocilizumab injection |
利用托珠参比品配制相对生物学活性分别为150%及50%的验证样品，按“2.4”项所述测定其相对生物学活性，计算本方法的回收率。经计算，本方法对150%验证样品的回收率为85.4%，对50%验证样品的回收率为112.9%，准确性较好（拟合曲线见图 4，测定结果见表 1）。
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图 4 报告基因法测定托珠注射液相对生物学活性回收率验证结果图（n=3） Figure 4 Luciferase reporter gene assay for determining the recovery rate of relative biological activity of tocilizumab injection |
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表 1 报告基因法测定托珠注射液相对生物学活性回收率验证结果（n=3） Table 1 Luciferase reporter gene assay for determining the recovery rate ofrelative biological activity of tocilizumab injection |
由同一实验人员针对同一批号的托珠单抗注射液样品的相对生物学活性进行3次独立测定，计算3次结果的RSD，以此评价本方法的重复性。结果见表 2。3次测定结果的RSD为14.4%，重复性较好。
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表 2 报告基因法测定托珠注射液相对生物学活性重复性验证结果 Table 2 Luciferase reporter gene assay for determining the repeatability of relative biological activityof tocilizumab injection |
单克隆抗体等大分子生物技术药物的理化性质与作用机制均十分复杂，仅靠理化表征的检测很难保证质量，因此必须根据其药物机理设计合适的生物学活性测定方法，对其有效性进行评价[10]。
荧光素酶报告基因法是一种基于已知信号传导通路的快速、灵敏，操作较简便的细胞水平检测方法，对分子作用机制明确的药物，基于报告基因法的生物学活性测定方法已有十分广泛的应用。如Sanchez等[11]利用报告基因系统解析独脚金萌发素内酯（strigolactones）结构与生物学活性的关系，刘春雨等[12]建立的抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性测定方法，张军要等[13]建立的重组人白介素-22生物学活性检测方法，张颖妹等[14]建立的白细胞介素1及白细胞介素1受体拮抗剂的生物活性测定方法等。本研究建立的IL-6受体拮抗剂生物学活性测定方法是基于JAK/STAT这一信号通路进行设计，通过转染、压力筛选后获得对IL-6刺激敏感的293T-SIE细胞株。通过条件优化，确认在细胞接种密度为每孔4×104个，IL-6刺激浓度为100 ng·μ L-1时，对相对生物学活性在50%~150%在托珠单抗注射液有准确的测定能力。与现有的基于KT-3细胞增殖抑制能力的测定方法相比，具有相似的准确性，但却将检测耗时由3 d减少至8 h之内，大大节约了相关产品放行或质量监督时的时间成本。同时，由于本研究构建的细胞株在培养过程中无需添加额外的细胞因子（KT-3细胞为IL-6依赖细胞），从而降低了试剂成本与培养难度，具有成为现有检测手段的替代方法的潜力。
本研究在数据分析时采用四参数回归模型，对不同浓度样品的发光信号进行非线性拟合，四参数回归模型用于S型曲线拟合效果好又相对简便，且各个参数具有较为实际的意义，因此目前被广泛使用[15]。根据段徐华等[16]的研究结果，分别对参比品与待测样品的结果进行四参数曲线拟合后，本研究还利用GraphPadPrism 5.0软件对上述曲线的平行性进行验证，在验证通过之后再进行相对生物学活性的计算，以保证结果的准确性。
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