2018, Vol. 38 
2. 中国食品药品检定研究院, 北京 100050
2. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China
罗米司亭（romiplostim），商品名为Nplate/Romiplate，可促进血小板生成，用于治疗慢性免疫性血小板减少性紫癜。
注射用重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白（简称TMP-Fc）为罗米司亭的生物类似药，是一种长效促血小板生成素（TPO）受体激动剂，在抗体Fc片段羧基端连接了2段TPO模拟肽，该模拟肽可以与巨核细胞表面TPO受体特异结合，通过转磷酸化激活胞质酪氨酸激酶JAK2，在JAK2的催化下，激活STATs、PI3K和Ras/MAPK等信号通路，进而促进巨核细胞增殖、分化，产生血小板，起到升高血小板数目的作用[1-2]。
罗米司亭和TMP-Fc发挥活性的原理与TPO一致，均能与巨核细胞表面TPO受体Mpl结合，进而引起巨核细胞增殖。文献报道有使用BaF3-hMpl细胞、UT-7/Mpl细胞和人巨核细胞白血病细胞株MO7e进行TPO体外活性检测[3-4]。
文献[5]指出，AMG531（即罗米司亭）与TPO均可促进BaF3-hMpl细胞增殖。BaF3-hMpl细胞、UT-7/Mpl细胞均为在原细胞基础上导入c-mpl基因[6-7]，进而在细胞表面表达TPO受体Mpl，细胞系构建技术复杂，周期长。MO7e是从白血病患者外周血中分离所得，天然表达TPO受体，不需要进行基因转染等修饰，较BaF3-hMpl和UT-7/Mpl细胞易于获得，常用于替代巨核细胞研究TPO对巨核细胞的作用[8]。
文献[8-9]报道MO7e细胞增殖曲线呈现TPO剂量依赖效应，据此开发并建立了TMP-Fc生物活性测定方法，通过加入不同浓度TMP-Fc与MO7e细胞作用，使细胞产生不同程度的增殖，采用显色法定量细胞增殖情况来反映TMP-Fc的生物学活性，无需任何改造，简单方便实用。为了确保细胞增殖法检测TMP-Fc生物活性的专属性和可靠性，本文对此方法的测定范围、线性、回收率和精密度进行考察，结果表明，此方法可准确定量TMP-Fc活性，精密度好，稳定可靠，可有效应用于TMP-Fc研制生产中的活性检测和质量控制。
1 材料 1.1 仪器二氧化碳细胞培养箱（Thermo）；SW-CJ-2FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；CKX41倒置相差显微镜（Olympus）；IEC-FL-40R台式离心机（Thermo）；Count Star细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）；Epoch酶标仪（Bio-tek）。
1.2 试剂RPMI-1640培养液（Gibco）；胎牛血清（Gibco）；青霉素/链霉素双抗溶液（Gibco）；CCK-8显色试剂盒（东仁化学科技上海有限公司）；甲基偶氮唑蓝（MTT）显色法（Gibco）；台盼蓝（Gibco）；粒细胞集落刺激因子GM-CSF（Pepro Tech）；二甲基亚砜（DMSO）（Sigma）。
1.3 样品TMP-Fc活性质控参考品：北京泰德制药股份有限公司生产，批号20131220，每支50 μg，-20 ℃存放60个月，60个月后定期检测，如符合质量标准可继续作为质控参考品。泰德与中国食品药品检定研究院分别多次测定参考品活性，计算其几何平均数并规定联合标定活性为10 000 U·支-1。
注射用TMP-Fc成品：北京泰德制药股份有限公司生产，批号D140115、D161228、D170104、D170108，每瓶275 μg，2~8 ℃存放36个月。使用时用520 μL注射用水溶解后终质量浓度为0.5mg·m L-1。
空白溶液：北京泰德制药股份有限公司配制，制剂中除有效成分外的辅液，含蔗糖、甘露醇、组氨酸、吐温20，2~8 ℃存放1个月。
阴性溶液：RPMI-1640培养液+10%胎牛血清（FBS）。
原研品：罗米司亭（romiplostim），Amgen产品，批号14Z02R、16601R、16602R，每瓶375 μg，2~8 ℃存放36个月。使用时用720 μL注射用水溶解后终质量浓度为0.5 mg·m L-1。
1.4 细胞系天津协和血液研究所提供的人巨核细胞白血病细胞株MO7e。
2 方法 2.1 细胞培养MO7e细胞为半悬浮生长细胞，生长用培养基为RPMI-1640培养液+10%FBS+GM-CSF（终质量浓度10 ng·m L-1），接种密度为5×104~10×104个·m L-1，于37 ℃、5% CO2的培养箱内培养，3~4 d传代1次，待细胞长至对数生长期可用于检测。
2.2 样品制备和细胞悬液制备用基础培养液（RPMI-1640+10%FBS）将样品进行5倍梯度稀释，最高样品质量浓度为2 500ng·m L-1，稀释9个梯度至0.006 4 ng·m L-1；将稀释好的样品溶液加入96孔细胞培养板中，每孔50 μL，每个样品2~3个复孔。
将处于对数生长期的细胞吹打混匀，800 r·min-1离心5 min收集MO7e细胞，用无血清培养液洗涤2次，用台盼蓝染色法和细胞计数仪计数活细胞，用基础培养液调整细胞密度为1.5×105~2.2×105个·m L-1，每孔150 μL加到已加样品的96孔细胞培养板中，37 ℃，5% CO2条件下培养48~72 h。
2.3 显色方法MTT显色法：每孔加入MTT 10 μL，再加入DMSO 100 μL，CO2培养箱中过夜孵育，待蓝紫色结晶甲臜（formazan）完全溶解后，用酶标仪测定490 nm处吸收值。
CCK-8显色法：每孔加入CCK-8 10 μL，CO2培养箱中孵育2 h，用酶标仪测定450 nm/600 nm处吸收值。
2.4 活性计算| $ 增值率{\rm{ = }}\frac{{\left( {{A_{样品450\;{\rm{nm}} - {\rm{600}}\;{\rm{nm}}}} - {A_{空白450\;{\rm{nm}} - {\rm{600}}\;{\rm{nm}}}}} \right)}}{{\left( {{A_{阴性450\;{\rm{nm}} - {\rm{600}}\;{\rm{nm}}}} - {A_{空白450\;{\rm{nm}} - {\rm{600}}\;{\rm{nm}}}}} \right)}} \times 100\% $ |
利用Gene5软件，以活性质控参考品和样品的浓度为横坐标，以对应的吸收度（A样品450 nm-600 nm-A空白450 nm-600 nm）为纵坐标，作四参数回归曲线，将活性质控参考品四参数曲线的（A+D）/2代入活性质控参考品和样品方程，分别计算活性质控参考品半效量的稀释倍数（Er）和样品相当于质控参考品半效量的稀释倍数（Es），按
| $ 比活性 = \frac{{样品活性\left( {{\rm{U}} \cdot {\rm{m}}{{\rm{L}}^{ - 1}}} \right)}}{{样品蛋白浓度\left( {{\rm{mg}} \cdot {\rm{m}}{{\rm{L}}^{ - 1}}} \right)}} $ |
按“2.2”项和“2.3”项（CCK-8显色法）所述方法进行试验，供试品为空白对照、阴性对照、最高浓度样品（2500 ng·m L-1）和最低浓度样品（0.006 4 ng·m L-1），各样品每孔50 μL按“2.2”项方法操作，CCK-8显色后测得到吸收度，评价培养上清对方法的干扰。
TMP-Fc产品中含有辅液，因此考察辅液成分对检测结果的影响，样品为无辅液TMP-Fc溶液和含辅液的制剂溶液（采用超滤换液方式获得无辅液TMP-Fc溶液），按“2.2”~“2.4”项下方法操作，进行检测分析，比较TMP-Fc添加辅液前后的EC50。
TMP-Fc为Fc融合蛋白，以另一Fc融合蛋白VEGFR-Fc作为对照，以50 μg·m L-1为起始浓度，按“2.2”~“2.4”项下方法操作，进行检测分析，作四参数回归曲线，评价该方法的专属性。
2.5.2 线性与范围活性质控参考品、TMP-Fc和原研品分别以50 μg·m L-1为起始浓度，按“2.2”项方法进行5倍梯度稀释，活性蛋白质量浓度为0.006 4~2 500 ng·m L-1，各3个平行孔，按上述CCK-8法显色，利用Gene5软件，以样品的质量浓度为横坐标，以对应的吸收度（A样品450 nm-600 nmm-A空白450 nm-600 nm）为纵坐标，作四参数回归曲线。
2.5.3 准确度取活性质控参考品制备成10 000、20 000、30 000 ng·m L-1 3种浓度的溶液，分别与TMP-Fc溶液（20 000 ngm L-1）与活性质控参考品溶液等体积混合，分别制成50%、100%、150%添加的回收率样品，按“2.2”项方法5倍梯度稀释，进行活性测定，并与质控参考品理论添加值进行比较，计算回收率。
2.5.4 精密度验证及多批次样品检测TMP-Fc和原研品各3批，分别按“2.2”和“2.3”项方法操作，重复测定3次，并按“2.4”项方法计算比活性，分析各批样品重复3次测定的RSD评价方法精密度。One-way ANOVA统计分析TMP-Fc和原研品各3批的活性测定结果，比对其生物学活性的相似性。
3 结果 3.1 方法建立及优化 3.1.1 显色方法MTT显色法原理基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，使用合适的裂解液如DMSO能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在490 nm波长处测定其吸收值，可间接反映活细胞数量。采用MTT法评价TMP-Fc对MO7e细胞的增殖效果，发现加入DMSO后过夜放置，次日蓝紫色结晶甲臜仍未完全溶解，无法准确测定其吸收值。
CCK-8试剂盒利用Dojindo开发的水溶性四唑盐-WST-8在电子载体1-甲氧基PMS存在的情况下，能够被还原成水溶性的橙黄色甲臜染料，生成的甲臜量与活细胞数量成正比[10-11]。采用CCK-8法评价TMP-Fc对MO7e细胞的增殖效果，显色后直接形成水溶性甲臜染料，省去甲臜溶解时间，操作简便，显色时间短（2 h）。根据文献[10, 12]报道，CCK-8法检测的OD值与活细胞数的相关度要优于MTT法，是一种灵敏度高、重复性好的细胞活性检测方法。因此，选择CCK-8显色法建立TMP-Fc活性检测方法。
3.1.2 TMP-Fc与MO7e细胞作用时间根据文献报道[9]，首先采用增值率评价TMP-Fc对MO7e细胞增殖的影响。当TMP-Fc作用浓度范围在0.032~100 ng·m L-1时，无法得到典型S型增殖曲线。将TMP-Fc作用浓度范围扩大至0.003 2~2 500 ng·m L-1或0.000 05~5 000 ng·m L-1，均可得到典型S型增殖曲线。图 1所示，TMP-Fc作用浓度范围为0.000 05~5 000 ng·m L-1，分别培养48 h和72 h，比较TMP-Fc作用时间对MO7e细胞增殖率的影响。72 h细胞活力（100%~1 100%）明显高于48 h（100%~600%），细胞增殖趋势更为明显且呈典型S型增殖曲线，可有效降低阴性对照干扰，因此确定该方法最佳作用时间为72 h。
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图 1 TMP-Fc作用48 h和72 h的细胞增值率曲线 Figure 1 Proliferation rate of MO7e cells with TMP-Fc varying from 48 h and 72 h |
采用增值率评价TMP-Fc对MO7e细胞增殖的影响，简便直观，但是不属于药品体外活性分析的常规方法，因此改用《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）活性分析常规方法。根据2015年版《中国药典》第三部附录3524~3528，多种细胞因子活性采用细胞法/MTT比色法测定，实验数据采用四参数回归法进行处理，最终计算出样品生物学活性。因此，采用四参数回归法处理数据，将半数有效浓度（EC50）定义为1个活性单位（U），根据四参数回归方程计算TMP-Fc生物学活性，并用活性质控参考品对结果进行校正。
3.1.4 样品稀释率对TMP-Fc分别进行2倍、5倍（图 2-A）、10倍（图 2-B）梯度稀释，检测结果表明，由于样品对数增长期范围较大，2倍梯度稀释不足以得到典型的四参数拟合曲线；5倍梯度稀释四参数曲线对数期数据点较10倍多，能更真实反映数据拟合，计算结果更为可靠。因此确定该方法最佳稀释倍数为5倍。
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A.5倍梯度稀释（dilution factor 5）B.10倍梯度稀释（dilution factor 10） 图 2 不同TMP-Fc稀释率条件下MO7e细胞增殖曲线 Figure 2 MO7e proliferation curves of different TMP-Fc dilution ratios |
方法中用培养液（RPMI-1640培养液+10%FBS）稀释样品，因此首先应考察培养液对结果的影响。如表 1所示，空白对照为培养3 d的细胞培养上清液，有一定吸收度，对结果有干扰作用，因此在数据处理时应扣除空白对照吸收值。
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表 1 专属性验证结果 Table 1 Results of specificity validation |
TMP-Fc产品中含有一定浓度的辅液，因此考察辅料成分对检测结果的影响，比较TMP-Fc添加辅液前后的EC50；检测结果分别为2.47 ng·m L-1和2.50 ng·m L-1，二者无明显差异，说明辅液对MO7e细胞无刺激/抑制作用，对检测结果无干扰，此方法用于检测TMP-Fc体外生物活性具有较好专属性。
TMP-Fc为Fc融合蛋白，以另一Fc融合蛋白VEGFR-Fc作为对照，以50 μg·m L-1为起始浓度，按“2.2”~“2.4”项方法操作，进行检测分析，做四参数回归曲线（图 3）。TMP-Fc作用于MO7e细胞呈典型S型增殖曲线，而VEGFR-Fc对MO7e细胞无作用，方法专属性良好。
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图 3 TMP-Fc促进MO7e细胞增殖的专属性曲线 Figure 3 Specificity curves of TMP-Fc stimulating MO7e cell proliferation |
活性质控参考品、TMP-Fc和原研品在TMP-Fc蛋白质量浓度为0.006 4~2 500ng·m L-1范围内均存在良好的剂量反应曲线，符合四参数方程并且呈典型S型曲线（图 4），相关系数均在0.99以上（表 2），符合线性与范围要求。TMP-Fc和原研品的剂量反应曲线见图 4，三者作用曲线基本重合，说明三者体外活性基本一致，TMP-Fc的检测结果可以最终用活性质控参考品进行校正。
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图 4 MO7e细胞增殖法检测TMP-Fc体外生物活性的线性与范围曲线 Figure 4 Linear and range curves of TMP-Fc bioactivity in vitro detected by MO7e cell proliferation assay |
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表 2 TMP-Fc活性检测四参数方程 Table 2 4-parameter equation for TMP-Fc activity detection |
TMP-Fc与活性质控参考品按照一定比例混合，分别制成50%、100%、150%添加的回收率样品，进行活性测定，并与质控参考品理论添加值进行比较，计算回收率在89%~108%之间（表 3），符合生物学活性测定的回收率要求。
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表 3 准确度验证结果 Table 3 Results of accuracy validation |
对3批TMP-Fc和3批原研品分别重复测定3次，计算比活性的RSD。其比活性平均值在193 152~228 549 U·mg-1之间（表 4），其RSD均小于15%。
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表 4 精密度验证结果 Table 4 Results of precision validation |
表 4结果经单因素方差分析（One-way ANOVA），组间差异P=0.169 6（P > 0.05，表 5）。结果显示不同批次的TMP-Fc与原研品罗米司亭的比活性无显著性差异，表明TMP-Fc与原研品生物学活性一致。
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表 5 One-way ANOVA分析结果 Table 5 One-way ANOVA analysis results |
罗米司亭在已上市国家被批准的适应症为：治疗对脾切除，糖皮质激素治疗以及免疫球蛋白注射等治疗方法反应均不显著的顽固性的免疫性血小板减少性紫癜（ITP）[2]。其活性位点以及整个氨基酸序列都与TPO没有同源性，因此它既不会和体内可能存在的TPO抗体发生中和反应，也不会引起免疫系统产生TPO抗体，更具安全性。
TMP-Fc作为罗米司亭生物类似药，同样具有重要的生物学功能和良好的临床应用前景，因而其生物活性检测作为质控的关键指标尤为重要。目前文献报道的罗米司亭活性测定方法主要有BaF3-hMpl细胞增殖法。但是这种方法所用细胞系BaF3-hMpl细胞是在原细胞基础上导入c-mpl基因，进而在细胞表面表达TPO的受体Mpl，细胞系的构建时间长，不易获得。文献方法采用存活率指标来评价罗米司亭对BaF3-mpl细胞增殖的影响，该方法简便直观，但是不属于药品体外活性分析的常规方法，因此改用《中国药典》活性分析常规方法。
本研究采用MO7e细胞增殖法测定TMP-Fc生物活性，MO7e细胞系来源于白血病患者外周血，天然表达TPO受体，不需要进行基因转染等改造。MO7e细胞经不同浓度的TMP-Fc刺激后呈现不同程度的增殖，采用显色法定量细胞增殖情况来反映TMP-Fc的生物学活性。根据2015年版《中国药典》三部收录的多种细胞因子活性采用细胞增殖法/MTT比色法测定[9]，以四参数回归法处理数据，并用活性质控参考品对结果进行校正。从显色方法、作用时间、样品稀释率3个方面对方法进行优化。该方法经过完整的方法学验证，试验结果表明该方法对TMP-Fc蛋白有很好的专属性，并且不受样品中辅料成分的干扰；在一定的浓度范围内有很好的剂量-反应相关作用曲线，回收率的试验结果在80%~120%之间，精密度试验的RSD在15%以内，对于生物活性测定方法来说有很高的准确度和精密度。采用该方法分别对3批原研品和3批TMP-Fc进行了测定，结果显示TMP-Fc与原研品的生物学活性一致。
生物活性检测是重组生物制品质量控制的重要内容，与理化检测相比变异性较大。本文通过对方法优化和验证，建立了一种专属性高，定量准确，精密度好，便于质控的TMP-Fc生物活性检测方法。该方法为今后TMP-Fc研制和生产中的质量控制提供了技术保障。
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