2018, Vol. 38 
多晶型现象[1-2]是指相同组成的化学物质存在于具有不同分子排列或分子构象的晶格中的2个或多个结晶状态，从而以2种或2种以上不同的晶体结构存在的现象。对于多晶型药物而言，其不同的固态形式表现出不同的物理化学性质，如溶解度、熔点、密度、硬度、颗粒形态，化学反应性和稳定性[3-4]。不同物质晶型的转变会强烈影响药物的生物利用度、疗效以及副作用[4]，因此，选择合适的药物晶型对于提高多晶型药物的产品质量和药效有着重要意义[5-6]，近年来，药物的多晶型研究受到了越来越多的重视和关注。
呋塞米俗称速尿，化学名称为2-[（2-呋喃甲基）氨基]-5-（氨磺酰基）-4-氯苯甲酸，是一种循环利尿药，常用于治疗充血性心力衰竭、慢性肾衰竭、水肿和高血压[7-9]，经常表现为高血压和流体过载状况，如充血性心力衰竭和肝硬化[10-11]。由于呋塞米的低水溶性和低渗透性，其属于Ⅳ类生物制药分类系统[12-13]。据文献报道[14]，呋塞米以3种多晶型，2种溶剂化合物和1种无定形形式存在，国内尚无呋塞米多晶型差异的相关文献报道。呋塞米为一致性评价药物，且在上海有生产厂家，研究此药物晶型为上海的制药研究提供了选取优势晶型的依据。
便携式薄层色谱-拉曼光谱联用仪是将微型薄层色谱仪与便携式拉曼光谱仪结合起来的新型仪器，同时两者又可分开独立完成薄层点样检测或拉曼光谱检测的工作。将样品溶液用薄层点样仪自动点样，经展开剂展开后由薄层色谱仪自动识别斑点，在展开的斑点位置喷拉曼增强凝胶后，立即用拉曼光谱仪采集拉曼光谱图。将采集的光谱图由数据库进行比较筛选，从而快速判定样品成分。联用仪中的便携式拉曼光谱仪又可独立进行光谱采集的工作，对未知的原辅料等粉末或者未知的药物制剂采集拉曼光谱图，经数据库比较筛选，快速锁定疑似成分。本文采用便携式薄层色谱-拉曼光谱联用仪对呋塞米多晶型进行了快速检测，补充了便携式分析终端设备（μTrait）及无线远程网络数据中心的呋塞米晶型拉曼图谱库。
本文采用X射线粉末衍射法、傅里叶变换红外光谱法、近红外光谱法、拉曼光谱法，对呋塞米多晶型进行了初步研究，对呋塞米晶型的变化和结晶的条件因素以及呋塞米固体制剂中存在的药用晶型进行了研究。
1 仪器与试药XRD-6000型X射线粉末衍射仪（日本岛津公司），Nicolet 5700型傅立叶变换红外光谱仪（美国Nicolet公司），Bruker MPA Near-IR光谱仪（德国布鲁克公司），DXR智能拉曼光谱仪（美国Thermo Nicolet公司），Nikon eclipse 80i显微镜（日本尼康公司），R10便携式薄层色谱-拉曼光谱联用仪（课题自主研发）。
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3种晶型按文献[15]方法自制，采用甲醇、正丁醇、丙酮等有机溶剂分别溶解呋塞米粉末，在一定条件重结晶得呋塞米晶型。原料为AMRI India Pvt，.Ltd公司生产（批号AM20215061、AM20215062、AM20215063、AM20215064）。
呋塞米片：每片20 mg，上海朝晖药业有限公司（国药准字00712H134），江苏亚邦爱普森药业有限公司（国药准字42028）。
2 方法与结果 2.1 晶型制备晶型Ⅰ：热饱和的呋塞米甲醇溶液室温析晶；晶型Ⅱ：热饱和的呋塞米正丁醇溶液室温析晶；晶型Ⅲ：呋塞米的丙酮溶液25 ℃减压旋转蒸发。
改变结晶条件制备其他晶型：（1）热呋塞米甲醇溶液在室温下静置；（2）热呋塞米乙醇溶液在室温下静置；（3）热呋塞米丙酮溶液在室温下静置；（4）向热呋塞米丙酮溶液中加入少量水，直到晶体开始分离；（5）热呋塞米甲醇溶液60 ℃减压旋转蒸发；（6）热呋塞米甲醇溶液20 ℃减压旋转蒸发；（7）热呋塞米乙醇溶液60 ℃减压旋转蒸发；（8）热呋塞米乙醇溶液20 ℃减压旋转蒸发。
2.2 显微镜在显微镜下晶型Ⅰ为薄片状晶体，晶型Ⅱ为细长针状晶体，晶型Ⅲ为小体积的无规则块状晶体。显微照片见图 1。
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图 1 呋塞米在不同溶剂中结晶得到的晶体形貌 Figure 1 Crystal morphology of furosemide crystallized in different solvents |
测试条件：铜靶，电压40 kV，电流40 mA。在3°~ 40°的2θ范围内记录晶型Ⅰ、晶型Ⅱ和晶型Ⅲ的X射线粉末衍射图谱，见图 2。所测得的3种晶型X射线粉末衍射图谱与文献记载一致。呋塞米原料的X射线粉末衍射图谱见图 3，与晶型Ⅰ的图谱基本一致。改变结晶条件制备的其他晶型的X射线粉末衍射图谱见图 4。呋塞米片剂的X射线粉末衍射图谱见图 5，特征峰与晶型Ⅰ基本一致。
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A.晶型Ⅰ（form Ⅰ）B.晶型Ⅱ（form Ⅱ）C.晶型Ⅲ（form Ⅲ） 图 2 呋塞米3种晶型X射线衍射图谱 Figure 2 X-ray powder diffraction patterns of furosemide modifications |
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图 3 呋塞米原料（A）及晶型Ⅰ（B）X射线衍射图谱 Figure 3 X-ray diffraction pattern of furosemide raw material(A)and form Ⅰ(B) |
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A.甲醇室温析晶（methanol solution of furosemide is allowed to stand at room temperature）B.乙醇室温析晶（ethanol solution of furosemide is allowed to stand at room temperature）C.丙酮室温析晶（acetone solution of furosemide is allowed to stand at room temperature）D.丙酮中加入少量水（addition of a small amount of water to hot acetone solution of furosemide until crystals begin to separate）E.晶型Ⅰ（form Ⅰ）F.甲醇60 ℃旋蒸（methanol solution evaporation-recrystallization in a rotary evaporator at 60 ℃）G.甲醇20 ℃旋蒸（methanol solution evaporation-recrystallization in a rotary evaporator at 20 ℃）H.乙醇60 ℃旋蒸（ethanol solution evaporation-recrystallization in a rotary evaporator at 60 ℃）I.乙醇20 ℃旋蒸（ethanol solution evaporation-recrystallization in a rotary evaporator at 20 ℃）J.晶型Ⅲ（form Ⅲ） 图 4 X射线粉末衍射图谱 Figure 4 X-ray powder diffraction pattern |
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A.上海朝晖呋塞米片（furosemide tablets from Shanghai Zhaohui）B.江苏亚邦爱普森呋塞米片（furosemide tablets from Jiangsu Yabang Epson）C.晶型Ⅰ（form Ⅰ） 图 5 呋塞米片剂的X射线衍射图谱 Figure 5 X-ray diffraction patterns of furosemide tablets |
采用溴化钾压片法，扫描次数20，分辩率4 cm-1，波数范围4 000~400cm-1，呋塞米3种晶型的傅里叶变换红外光谱图见图 6。呋塞米原料的红外光谱图见图 7，与晶型Ⅰ的图谱基本一致。改变结晶条件制备的其他晶型的红外光谱图谱见图 8。呋塞米片剂的红外光谱图谱见图 9，特征峰与晶型Ⅰ基本一致。
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A.晶型Ⅰ（form Ⅰ）B.晶型Ⅱ（form Ⅱ）C.晶型Ⅲ（form Ⅲ） 图 6 呋塞米3种晶型傅里叶变换红外光谱图 Figure 6 Fourier transform infrared spectra of furosemide modifications |
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图 7 呋塞米原料（A）与晶型Ⅰ（B）的傅里叶变换红外光谱图 Figure 7 Fourier transform infrared spectra of furosemide raw material(A)and form Ⅰ(B) |
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A~C.同图 5（the same as Fig. 5） 图 9 呋塞米片剂的傅里叶变换红外光谱图 Figure 9 Fourier transform infrared spectra of furosemide tablets |
以仪器自带Spectralon为背景，测量背景光谱；扫描范围为12 000~4 000 cm-1，分辨率为8 cm-1，每张光谱的扫描次数为32次，呋塞米3种晶型的近红外光谱图见图 10。呋塞米原料的近红外光谱图谱见图 11，与晶型Ⅰ的图谱基本一致。改变结晶条件制备的其他晶型的近红外光谱图谱见图 12。呋塞米片剂的近红外光谱图谱见图 13，特征峰与晶型Ⅰ基本一致。
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A.晶型Ⅰ（form Ⅰ）B.晶型Ⅱ（form Ⅱ）C.晶型Ⅲ（form Ⅲ） 图 10 呋塞米3种晶型的近红外光谱图 Figure 10 Near-infrared spectra of furosemide modifications |
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图 11 呋塞米原料（A）与晶型Ⅰ的近红外光谱图 Figure 11 Near-infrared spectra of furosemide raw material(A)and form Ⅰ(B) |
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A~C.同图 5（the same as Fig. 5） 图 13 呋塞米片剂的近红外光谱图 Figure 13 Near-infrared spectra of furosemide tablets |
拉曼光谱的扫描范围3 349~56 cm-1，曝光时间10 s，累加次数10次，激光强度150 mW，呋塞米3种晶型的拉曼光谱图见图 14。呋塞米原料的拉曼光谱图谱见图 15，与晶型Ⅰ的图谱基本一致。改变结晶条件制备的其他晶型的拉曼光谱图谱见图 16。呋塞米片剂的拉曼光谱图谱见图 17，特征峰与晶型Ⅰ基本一致。
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A.晶型Ⅰ（form Ⅰ）B.晶型Ⅱ（form Ⅱ）C.晶型Ⅲ（form Ⅲ） 图 14 呋塞米3种晶型的拉曼光谱图 Figure 14 Raman spectra of furosemide modifications |
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图 15 呋塞米原料（A）与晶型Ⅰ（B）拉曼光谱图 Figure 15 Raman spectra of furosemide raw material(A)and form Ⅰ(B) |
2.7 便携式薄层色谱-拉曼光谱联用仪
扫描范围2 800~159 cm-1，积分时间5 s（晶型Ⅰ，Ⅲ）、积分时间10 s（晶型Ⅱ），激光功率100%，平均次数3次，呋塞米3种晶型的光谱图见图 18。
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A.晶型Ⅰ（form Ⅰ）B.晶型Ⅱ（form Ⅱ）C.晶型Ⅲ（form Ⅲ） 图 18 呋塞米原料的便携式薄层色谱-拉曼光谱联用光谱图 Figure 18 Portable TLC-Raman spectroscopic map of furosemide raw material |
本研究使用显微镜法、X射线粉末衍射法、傅里叶变换红外光谱法、近红外光谱法、拉曼光谱法等，对呋塞米的多态性进行初步研究和表征。呋塞米3种晶型X射线粉末衍射法结果如图 2所示，晶型Ⅰ在6.05°、18.13°和24.80°处有特征衍射峰，晶型Ⅱ在6.48°、17.29°和19.76°处有特征衍射峰，晶型Ⅲ在19.82°、24.83°和26.21°处有特征衍射峰。傅里叶变换红外光谱图如图 6所示，3种晶型在3 500~3 200 cm-1及800~450 cm-1范围内有显著差别。近红外光谱图如图 10所示，3种晶型在6 980~4 008 cm-1之间有显著差异。拉曼光谱图如图 14所示，3种晶型在3 170~2 850 cm-1及1 700~120 cm-1的范围内有显著差异。研究表明，X射线粉末衍射法、傅里叶变换红外光谱法、近红外光谱法、拉曼光谱法等均能有效地鉴别呋塞米的多晶型样品。
本研究对AMRI IndiaPvt，.Ltd公司生产的呋塞米原料进行了X射线粉末衍射（见图 3）、傅里叶变换红外光谱扫描（见图 7）、近红外光谱扫描（见图 11）、拉曼光谱扫描（见图 15），将其结果与3种晶型的图谱进行比较，研究表明其晶型均为晶型Ⅰ。
采用显微镜法观察呋塞米晶型Ⅰ时，从晶体表面突出的类似针状的晶体可能是由晶型Ⅰ转变形成的“晶须”，如图 19所示。
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图 19 晶体表面突出的类似针状的晶须 Figure 19 A needle-like whisker resulting from the crystal surface |
在制备呋塞米3种晶型时发现，经过有机溶剂重结晶的晶体长时间暴露在光下，会逐渐变色，由白色变为米黄色，见图 20，且呋塞米粉末溶解在水相或有机溶剂中长时间光照会出现光降解反应，故建议将呋塞米避光保存。
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图 20 新鲜结晶的白色晶体（A）与长时间暴露在光下的米黄色晶体（B） Figure 20 The freshly-crystallized white crystals(A)and crystals exposed to light for a long time(B) |
晶体结晶的方式不同，得出的晶型也不同。本研究将呋塞米在甲醇、乙醇、丙酮3种热有机溶剂中溶解，在室温下静置析晶或在旋转蒸发仪中旋转蒸发，或在热的丙酮溶液中加入少量水进行结晶，所得到的晶体进行了X射线粉末衍射（见图 4）、傅里叶变换红外光谱扫描（见图 8）、近红外光谱扫描（见图 12）、拉曼光谱扫描（见图 16）。将实验结果与3种晶型比较，发现室温静置制得的均为晶型Ⅰ，旋转蒸发制得的均为晶型Ⅲ，在热丙酮溶液中加入少量水制得的为晶型Ⅰ。而晶型Ⅱ是在正丁醇溶液中缓慢析晶所得，由此可见，在低沸点溶剂中重结晶容易得到晶型Ⅰ，在沸点高的溶剂中结晶容易得到晶型Ⅱ。
从药物原料到固体制剂成品，需要经过多步加工过程，如混合、填充、粉碎，这些加工工艺都可能使药物晶型发生改变，进而影响疗效。本研究将呋塞米片剂磨粉，进行X射线粉末衍射（见图 5）、傅里叶变换红外光谱扫描（见图 9）、近红外光谱扫描（见图 13）、拉曼光谱扫描（见图 17），将实验结果与3种晶型比较，发现呋塞米片剂中的药用晶型均为晶型Ⅰ。
采用便携式薄层色谱-拉曼光谱联用仪能快速鉴别呋塞米3种晶型，如图 18可见，3种晶型在1 659~159 cm-1的范围内有显著差异。和常规拉曼光谱相比较，便携式薄层色谱-拉曼光谱联用仪测量范围较窄，对于晶型Ⅱ的鉴别没有常规拉曼光谱清晰。但是便携式拉曼光谱仪更加轻便快捷，可以直接带到现场进行检测，为便携式薄层色谱-拉曼光谱联用仪的药品快检系统提供了支撑。本研究也完善了便携式分析终端设备（μTrait）及无线远程网络数据中心的呋塞米晶型拉曼图谱库，为今后市场上流通药品的呋塞米晶型快速检测提供了依据。
由于同一药物的不同晶型在外观、溶解度、熔点、溶出度、生物有效性等方面可能会有显著不同，从而影响药物的稳定性、生物利用度及疗效[16]，药物的多晶型研究在药品质量控制中得到了越来越多的重视。本实验研究了呋塞米的3种晶型表征方法，为其制剂标准的制定及优势晶型的选取提供了一定的依据。在下一步研究中将对其在制剂中的转化情况及各晶型的生物等效性是否一致进行考察。
| [1] |
周肖寅, 刘峥, 冯小珍. 药物多晶型现象研究进展[J]. 化学与生物工程, 2010, 27(10): 1. ZHOU XY, LIU Z, FENG XZ. Research advance of drug polymorphism[J]. Chem Bioeng, 2010, 27(10): 1. DOI:10.3969/j.issn.1672-5425.2010.10.001 |
| [2] |
赵沁元, 吴洁莹, 沈志滨. 红外光谱技术在药物多晶型分析中的应用[J]. 广州化工, 2013, 41(10): 34. ZHAO QY, WU JY, SHEN ZB. Application of infrared spectroscopy in pharmaceutical polycrystalline analysis[J]. Guangzhou Chem Ind, 2013, 41(10): 34. DOI:10.3969/j.issn.1001-9677.2013.10.014 |
| [3] |
GARNERO C, CHATTAH AK, LONGHI M. Stability of furosemide polymorphs and the effects of complex formation with β-cyclodextrin and maltodextrin[J]. Carbohydr Polym, 2016, 152: 598. DOI:10.1016/j.carbpol.2016.07.006 |
| [4] |
AYALA AP, HONORATO SB, FILHO JM, et al. Thermal stability of aripiprazole monohydrate investigated by Raman spectroscopy[J]. Vib Spectrosc, 2010, 54(2): 169. DOI:10.1016/j.vibspec.2010.09.011 |
| [5] |
刘文举, 孙晨, 郭亚军, 等. 卡马西平多晶型结晶工艺研究[J]. 精细化工, 2015, 32(11): 1248. LIU WJ, SUN C, GUO YJ, et al. Crystallization process studies of carbamazepine polymorph[J]. Fine Chem, 2015, 32(11): 1248. |
| [6] |
马乐伟, 杜葳, 赵春顺. 药物晶型定量分析方法的研究进展[J]. 药学学报, 2011, 46(8): 896. MA LW, DU W, ZHAO CS. Advances in the quantitative analytical methods of drug polymorphism[J]. Acta Pharm Sin, 2011, 46(8): 896. |
| [7] |
GARNERO C, CHATTAH AK, LONGHI M. Supramolecular complexes of maltodextrin and furosemide polymorphs:a new approach for delivery systems[J]. Carbohydr Polym, 2013, 94(1): 292. DOI:10.1016/j.carbpol.2013.01.055 |
| [8] |
KODATI D, YELLU N. Population pharmacokinetic modeling of furosemide in patients with hypertension and fluid overload conditions[J]. Pharmacol Rep, 2017, 69(3): 492. DOI:10.1016/j.pharep.2017.01.006 |
| [9] |
BOLUKBASI O, YILMAZ A. X-ray structure analysis and vibrational spectra of Furosemide[J]. Vib Spectrosc, 2012, 62(9): 42. |
| [10] |
KITSIOS GD, MASCARI P, ETTUNSI R, et al. Co-administration of furosemide with albumin for overcoming diuretic resistance in patients with hypoalbuminemia:a meta-analysis[J]. J Crit Care, 2014, 29(2): 253. DOI:10.1016/j.jcrc.2013.10.004 |
| [11] |
HEIDARIMOGHAGAM R, FARMANY A. Rapid determination of furosemide in drug and blood plasma of wrestlers by a carboxy-MWCNT sensor[J]. Mater Sci Eng:C, 2016, 58: 1242. DOI:10.1016/j.msec.2015.09.062 |
| [12] |
GARNERO C, CHATTAH AK, LONGHI M. Improving furosemide polymorphs properties through supramolecular complexes of β-cyclodextrin[J]. J Pharm Biomed Anal, 2014, 95: 139. DOI:10.1016/j.jpba.2014.02.017 |
| [13] |
BARBOSA SF, TAKATSUKA T, TAVARES GD, et al. Physical-chemical properties of furosemide nanocrystals developed using rotation revolution mixer[J]. Pharm Dev Technol, 2016, 21(7): 812. DOI:10.3109/10837450.2015.1063650 |
| [14] |
GE M, LIU GF, MA SH, et al. Polymorphic forms of furosemide characterized by THz time domain spectroscopy[J]. Bull Kor Chem Soc, 2009, 30(10): 33242. |
| [15] |
OLCAY B, AYBERK Y. X-ray structure analysis and vibrational spectra of furosemide[J]. Vib Spectrosc, 2012, 62(9): 42. |
| [16] |
石云峰, 杨伟峰, 杨丽珍, 等. 激光显微共聚焦拉曼光谱研究卡马西平片晶型及其判别模型的建立[J]. 中国药学杂志, 2016, 51(19): 1690. SHI YF, YANG WF, YANG LZ, et al. Analysis of the polymorphs of carbamazepin tablets by laser confocal micro-Raman spectrometer and establishment of the identification test model[J]. Chin Pharm J, 2016, 51(19): 1690. |