2018, Vol. 38 
丁苯酞又名芹菜甲素, 是一种治疗脑卒中的新药, 通过影响花生四烯酸的代谢, 减少后者诱导的血小板聚集作用, 从而改善脑部缺血的症状。药理实验表明, 丁苯酞对电刺激、震颤素、谷氨酸钠引起动物的惊厥有保护作用, 有抗脑缺血损伤活性[1-4], 此外, 丁苯酞可明显改善帕金森病合并抑郁症患者的抑郁症状[5]。恩必普丁苯酞软胶囊是我国脑血管病领域第1个也是目前唯一拥有自主知识产权的化学类一类新药, 能有效改善急性缺血性卒中患者的神经功能缺损, 且不良反应少, 未见严重不良反应[6-9]。
目前急性脑梗死已经成为威胁人们生命健康的常见疾病之一, 具有高致残率和致死率, 给家庭和社会造成重大损失, 但丁苯酞的相关研究还比较缺乏, 对血浆中丁苯酞浓度测定存在方法复杂, 灵敏度较高, 方法学验证不严谨等问题[1, 10-11]。
本文采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定犬血浆中丁苯酞浓度, 蛋白沉淀法处理样本, 具有线性范围广, 灵敏度高, 操作简便, 准确快速等特点, 用于丁苯酞犬血浆中浓度的测定。此方法符合2015年版《中华人民共和国药典》、《化学药物临床前药代动力学研究技术指导原则》和《生物样品分析国际规范》的有关要求。
1 仪器与试药Agilent 1260-6460液相色谱质谱联用系统(LC-MS/MS, 安捷伦科技有限公司), 包括G1322A型脱气机、G1312B型二元输液泵、G1367E型自动进样器、G1330B型控温模块、G1316A型柱温箱、6460MS/MS系统及Masshunter数据采集软件; Agilent Poroshell120EC-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm, 2.7 µm); XL16K-T台式高速冷冻离心机(湖南湘立科学仪器有限公司); Vortex Genius 3涡旋仪(广州仪科实验技术有限公司)。
丁苯酞对照品(纯度99.6%, 批号518160103, 石药集团恩必普药业有限公司); 内标地西泮(中国食品药品检定研究院, 批号171225-201304);乙腈(色谱纯, 批号106246, Fisher Scientific); 水为Advantage A10 Milli-Q超纯水机制备的超纯水。
2 溶液的配制 2.1 对照品工作液及质控溶液精密称取丁苯酞10 mg, 置10 mL量瓶中, 乙腈稀释并定容至刻度, 配成质量浓度为1 mg·mL-1的母液。平行配制2份, 标注为对照品储备液-1及对照品储备液-2, 分别用乙腈稀释成为20 000、10 000、7 500、5 000、2 000、1 000、500、50、20 ng·mL-1系列对照品工作液及18 000、2 000、50和20 ng·mL-1质控溶液。储存于4 ℃冰箱。
2.2 内标溶液精密称取地西泮10 mg, 置100 mL量瓶中, 以乙腈溶解并定容至刻度, 配成质量浓度为100 µg·mL-1的内标储备液; 用移液枪移取储备液0.5 mL至100 mL量瓶中, 以乙腈稀释至刻度, 配成质量浓度为500 ng·mL-1的内标溶液。
2.3 血浆样本的制备分别取20 000、10 000、7 500、5 000、2 000、1 000、500、50、20 ng·mL-1系列对照品工作液20 µL, 加入Beagle犬空白血浆(抗凝剂为肝素钠)180 µL涡旋混匀, 以乙腈配成质量浓度分别为2 000、1 000、750、500、200、100、50、5、2 ng·mL-1系列标准血浆样品。储存于-20 ℃冰箱。
分别取18 000、2 000、50和20 ng·mL-1质控溶液20 µL, 加入Beagle犬空白血浆(抗凝剂为肝素钠)180 µL, 涡旋混匀, 以乙腈配成质量浓度分别为2(定量下限)、5(低)、200(中)和1 800 ng·mL-1(高)质控血浆样品。储存于-20 ℃冰箱。
3 样本处理方法取血浆样本100 µL, 置于1.5 mL离心管中, 加入内标溶液300 µL, 涡旋混匀2 min, 10 000 r·min-1离心5 min, 取上清液于进样小瓶中, 进样检测。
4 分析条件色谱条件:采用Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm, 2.7 µm), 水-乙腈(65:35)为流动相, 流速0.4 mL·min-1, 柱温40 ℃, 进样量5 µL, 分析时间4.5 min。
质谱条件:采用Agilent 6460三重四极杆串联质谱仪, 离子化方式为电喷雾-正离子(API-ES), 干燥气为N2, 干燥气流速11 L·min-1, 干燥气压力0.31 MPa, 干燥气温度为350 ℃, 毛细管电压4 kV。监测方式为MRM, 丁苯酞监测离子对m/z 191.0/144.9, 地西泮监测离子对m/z 285.1/193.1。
本文条件下色谱图见图 1。
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图 1 丁苯酞(A)和地西泮(B)的色谱图 Figure 1 Chromatograms of butyphthalide(A)and diazepam(B) |
分别取6个不同个体的空白基质(加入乙腈代替内标溶液)、标准血浆样品(加入乙腈代替内标溶液)、空白血浆(加入内标溶液), 犬灌胃丁苯酞0.5 h后的血浆样本(加入内标溶液), 按“3”项下方法操作, 得到色谱图。血浆中内源性物质和其他代谢产物在丁苯酞和内标出峰处均无干扰。
5.2 标准曲线和定量下限按“2”项下方法操作, 配制成标准血浆样品, 按“3”项下方法操作, 以分析物的质量浓度X为横坐标, 分析物与内标物的峰面积比值Y为纵坐标, 用加权最小二乘法(权重为1/X2)进行回归运算, 求得直线回归方程: Y=0.046 2X+0.010 2 r=0.995 9
线性范围为2~2 000 ng·mL-1, 配制质控血浆样品, 按“3”项下方法操作, 每一浓度5个平行样本, 3个分析批分3 d进行, 以当日标准曲线算得。
5.3 准确度与精密度按“2”项下方法操作, 配制质量控制血浆样品, 按“3”项下方法处理, 每一浓度5个平行样本, 3个分析批分3 d, 在“4”项下条件下进行测定, 以当日标准曲线算得分析物的浓度, 并计算样本的批内及与批间准确度和精密度。结果见表 1, 批内和批间精密度不超过±15%, 回收率在85%~115%内。
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表 1 准确度与精密度结果 Table 1 Results of precision and accuracy |
使用6批来自不同个体的空白基质, 通过计算基质存在下的峰面积(由空白基质提取后加入分析物和内标测得)与不含基质的相应峰面积(分析物和内标的纯溶液)计算基质效应。该测定在定量下限、低、中和高浓度下进行。
通过计算基质中的峰面积(由空白基质中加入分析物和内标), 与不含基质的相应峰面积(分析物和内标的纯溶液)计算回收率。该测定在定量下限、低、中、高浓度下进行。
定量下限、低、中、高4个浓度中的基质效应与回收率结果见表 2。
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表 2 基质效应与回收率(n=6) Table 2 Results of matrix effect and recovery test |
采用定量下限、低、中、高浓度质控样品, 每一浓度5个平行样本, 分别考察样品处理温度(室温)下放置6 h、3个冷冻/解冻周期、30 d -20 ℃储存以及处理后的样本自动进样器内放置24 h的稳定性。结果见表 3, 表明丁苯酞在不同条件下稳定性良好。
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表 3 丁苯酞在不同条件下的稳定性(n=5) Table 3 Stability of butyphthalide under different conditions |
健康比格犬6只, 雌雄各半, 普通级, 北京玛斯生物技术有限公司提供, 实验动物生产许可证号为SCXK(京)2010-0003。禁食但可自由饮水, 单剂量灌胃丁苯酞(20 mg·kg-1), 于给药前和给药后5、15、30 min及1、1.5、2、2.5、2、4、6、8、10、24 h后肢静脉取血约1 mL, 置肝素抗凝管中, 离心(8 000 r·min-1, 5 min)制备血浆, 置于-20 ℃冰箱储存。采用上述验证的液相色谱-串联质谱法测定Beagle犬血浆中丁苯酞的浓度, 采用DAS2.0实用药代动力学程序, 以非房室模型计算其药代动学参数, 绘制平均血药浓度-时间曲线(见图 2), 主要药代动学参数结果如下: Tmax为(0.52±0.09) h, Cmax为(1 625±273)µg·L-1, AUC(0-24 h)为(5 076±751)µg·L-1·h-1, t1/2为(1.26±0.11) h。
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图 2 Beagle犬给予丁苯酞(20 mg·kg-1)平均血药浓度-时间曲线 Figure 2 The mean drug plasma concentration-time curcues of butyphthalide(20 mg·kg-1) |
丁苯酞是国家级一类新药, 是目前我国治疗缺血性脑血管病的一剂良药[12-13], 本文提供了1种测定犬血浆中丁苯酞浓度的方法。以地西泮为内标, 采用蛋白沉淀法预处理血浆样本后, 经液相色谱-串联质谱系统检测, 内标法计算得到犬血浆中丁苯酞浓度, 与其他方法[14]相比, 本文具有线性范围广, 灵敏度高, 操作简便, 准确快速等特点, 可用于药代动力学研究中丁苯酞在犬血浆中浓度的测定。
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