2018, Vol. 38 
胱氨酸(CySSCy)和半胱氨酸(CySH)是构成蛋白质的重要氨基酸, 在生理学上起着十分重要的作用。胱氨酸的定量测定多采用溴-亚铁滴定法、比色法、溴量法等[1-3]; 半胱氨酸测定多采用碘量法、电化学法、HPLC-MS/MS法、旋光度法、单扫描极谱法、流动注射荧光法[4-9]等; 复杂样品中胱氨酸和半胱氨酸同步分析报道较少, 库伦滴定法[5]和电位滴定法[6]实现了混合物中胱氨酸和半胱氨酸的同时测定, 但所用滴定剂碘和溴具有挥发性和腐蚀性, 给实际分析工作带来不便; 汞离子作滴定剂, 安全性受到质疑, 且除杂程序烦琐。电化学方法由于具有灵敏度高, 快速简便, 成本低廉等优点而更具有优势。
胱氨酸还原性较弱, 在pH=6时, 胱氨酸与亚硫酸氢钠定量反应生成还原性更强的半胱氨酸, 该反应转化为半胱氨酸的回收率达99 %以上[7]。
[Fe(CN)6]3-是一个具有高选择性的弱氧化剂, 能氧化半胱氨酸而不能氧化胱氨酸和亚硫酸根离子; [Fe(CN)6]3-又是基准物质, 可以直接配制标准溶液, 同时, [Fe(CN)6]3-具有电化学活性, 可以在未加修饰的玻碳电极上产生强烈电化学响应, 方波伏安法是一种多功能、快速、高灵敏度和高效能的电分析方法, 峰电流与[Fe(CN)6]3-浓度有很好的线性关系。半胱氨酸电化学活性较弱, 但半胱氨酸分子中的巯基(-SH)可将[Fe(CN)6]3-还原为[Fe(CN)6]4-, [Fe(CN)6]3-浓度差即为半胱氨酸浓度, 根据亚硫酸氢钠加入前后半胱氨酸增加量求得样品中胱氨酸含量。
1 实验部分 1.1 仪器与试剂CHI600E电化学工作站(上海辰华仪器公司), 三电极系统, 活化玻碳电极为工作电极, 铂丝为对电极, 饱和甘汞电极为参比电极。数控超声波清洗器(昆山市超声仪器); pHS-3C型数字式酸度计(上海科析实验仪器厂)。
胱氨酸、半胱氨酸(上海蓝季生物有限公司)标准溶液: 0.020 00 mol·L-1; K3[Fe(CN)6]标准溶液: 0.020 00 mol·L-1; 10% NaHSO3; 0.5 mol·L-1 H2SO4。所用试剂均为分析纯, 水为二次蒸馏水。
1.2 电极极化处理将玻碳电极(GCE)在人造毛绒上以α-Al2O3(粒度为0.05 μm, BDH)抛光成镜面, 用水冲洗干净, 依次在1:1硝酸、无水乙醇和二次蒸馏水中清洗5 min, 置于0.5 mol·L-1的H2SO4溶液中, 用循环伏安法在电位范围-1.0~1.0 V循环扫描10次活化(扫描速度: 0.1 V ·s-1), 取出, 用水冲洗干净即可用于测定。
1.3 检测方法 1.3.1 半胱氨酸测定取0.020 00 mol·L-1[Fe(CN)6]3-标准溶液5.00 mL以及适量半胱氨酸10 mg于50 mL量瓶中, 室温静置反应15 min, 用0.1 mol·L-1 KCl溶液定容至50.00 mL, 摇匀后即为半胱氨酸测试液。
将三电极系统置于测试液中, 利用方波伏安法(SWV)测定测试液中剩余[Fe(CN)6]3-在玻碳电极上的还原峰电流, 计算出空白[Fe(CN)6]3-对照测试液与半胱氨酸反应测试液的还原峰电流值的差值(简称还原峰电流差), 绘制还原峰电流差与半胱氨酸浓度之间的关系曲线, 根据样品反应液的响应电流, 计算得到样品中半胱氨酸的含量。
1.3.2 胱氨酸测定取适量胱氨酸或半胱氨酸和胱氨酸混合体(0.02 mol·L-1左右)于50 mL量瓶中, 加入2滴10%亚硫酸氢钠静置反应10 min, 再加0.020 00 mol·L-1 [Fe(CN)6]3-标准溶液5.00 mL, 室温静置反应15 min, 用0.1 mol·L-1 KCl溶液定容至50.00 mL, 摇匀后即为胱氨酸测试液。方法同前测定胱氨酸测试液中半胱氨酸含量, 2次差值即为胱氨酸含量值。
1.3.3 SWV测定条件起始电位为0.6 V, 终止电位为-0.1 V(或-0.3 V), 电位增量为0.004 V, 方波振幅为0.025 V, 方波频率为15 Hz。
2 结果与讨论 2.1 不同物质在玻碳电极上的电化学行为以玻碳电极为工作电极, 采用循环伏安法(CV), 在不同测试溶液中进行扫描, 结果见图 1。半胱氨酸和胱氨酸无电化学响应(图 1-c、d); [Fe(CN)6]3-在182 mV和254 mV处出现1对可逆的氧化还原峰(图 1-a), △E≈70 mV, Ipa/Ipc≈1:1(氧化峰与还原峰电流之比), 即[Fe(CN)6]3-的伏安行为是一个可逆的氧化还原过程。当加入半胱氨酸后, 峰电位正移, 峰电流同步下降(图 1-b); 加入胱氨酸后, [Fe(CN)6]3-循环伏安图基本保持不变。由此可见, [Fe(CN)6]3-是一个具有高选择性的弱氧化剂, 能氧化半胱氨酸而不能氧化胱氨酸; 以[Fe(CN)6]3-为底液的间接伏安法选择测定半胱氨酸具有一定的可行性。
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a. 1 mmol·L-1[Fe(CN)6]3- b. 1 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-+0.5 mmol·L-1 CySH c. 1 mmol·L-1 CySH d. 1 mmol·L-1CySSCy 图 1 不同测试液在玻碳电极上的循环伏安图(流速: 0.1 V·s-1) Figure 1 Cyclic voltammetry of different test fluid at the GCE(scanning rate: 0.1 V·s-1) |
配制[Fe(CN)6]3-标准系列, 方波伏安法测定还原峰电流, 由图 2可知, [Fe(CN)6]3-浓度C(mmol·L-1)在0~2 mmol·L-1范围内与还原峰电流I(μA)有良好的线性关系, 线性方程: I=33.12C-0.366 3 r=0.999 1
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a~ j. 0.039, 0.078, 0.156, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 mmol·L-1, respectively 图 2 [Fe(CN)6]3-方波伏安图(内插图表示Ipc与C的关系) Figure 2 Square wave voltammograms of [Fe(CN)6]3-(inset is Ipc vs c) |
由此说明, 以[Fe(CN)6]3-为底液的间接方波伏安法测定半胱氨酸含量具有一定的准确性, 选用0.020 00 mol·L-1 [Fe(CN)6]3-标准溶液5.00 mL作反应液, 稀释浓度为2 mmol·L-1。
2.2.2 反应与稀释定容先后顺序的确定实验证实, 在小体积高浓度情况下, 完成半胱氨酸彻底氧化后, 再用0.1 mol·L-1 KCl溶液定容, 还原峰电流差达到最大且保持恒定, 这是因为高浓度可以加快反应速度, 减少副反应, 避免半胱氨酸被溶解氧所氧化。实验是将[Fe(CN)6]3-标准溶液5.00 mL以及适量半胱氨酸于50 mL量瓶中室温静置反应15 min, 再用0.1 mol·L-1 KCl溶液定容。
2.2.3 反应时间的优化半胱氨酸的反应时间会影响到反应液中剩余[Fe(CN)6]3-的含量, 从而影响半胱氨酸的测定结果。取半胱氨酸标准溶液2.5 mL与[Fe(CN)6]3-标准溶液5.00 mL混合, 室温静置反应5、10、15和20 min, 研究反应液在玻碳电极上的响应电流差值时间的变化关系, 结果如图 3所示。反应时间为15 min时, 半胱氨酸反应液的响应电流差值明显达到最大, 说明此时半胱氨酸已反应完全。当反应低于15 min时, 由于反应时间过短, 半胱氨酸未能完全反应, 导致半胱氨酸的测定结果偏低; 当反应超过20 min时, 由于溶液中新生成的[Fe(CN)6]4-部分被溶解氧化为[Fe(CN)6]3-, 电流差值变小, 同样使半胱氨酸的测定结果偏低。因此, 选择15 min作为最优反应时间。
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图 3 反应时间对测定结果的影响(CCySH=1 mmol·L-1) Figure 3 The influence of reaction time on the determination results(CCySH=1 mmol·L-1) |
取不同体积半胱氨酸标准溶液, 然后进行氧化和测定, 得到不同浓度方波伏安曲线, 如图 4所示, 随着半胱氨酸浓度增加, 反应液在玻碳电极上的响应电流逐渐减小, 电流差△I(μA)与半胱氨酸浓度C(mmol·L-1)在0~1.8 mmol·L-1范围内呈良好的线性关系(图 4内插图), 线性方程为: △I=33.41C-1.643 0 r=0.999 1
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a→h. 0、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L-1 图 4 不同浓度半胱氨酸反应液方波伏安图(内插图表示△I与CCySH的关系) Figure 4 Square wave voltammograms of different concentrations of homocysteine reaction liquid(inset is the △I vs CCySH plot) |
基于3倍的信噪比(S/N=3), 得到半胱氨酸的检测下限为0.9 µmol·L-1。
2.4 干扰试验以1 mmol·L-1半胱氨酸反应液为对照, 采用方波伏安法考察10倍浓度的淀粉、糊精、硬脂酸镁、HSO32-对测定半胱氨酸的干扰情况。加入上述干扰物质后, 半胱氨酸反应液在玻碳电极上的响应电流没有明显变化, 表明以上物质对半胱氨酸的测定均无明显干扰; 同浓度抗坏血酸、葡萄糖有干扰。但胱氨酸片剂辅料中不存在这些物质, 由此玻碳电极方波伏安法可以实现对半胱氨酸和胱氨酸的选择性检测。
2.5 样品分析取胱氨酸片剂(山西云鹏制药有限公司, 标示量为每片50 mg)100片, 研细, 另加L-半胱氨酸(上海蓝季生物, BR级)2.0 g, 搅拌溶解, 用水定容至1 000 mL, 取2.00 mL, 按上述方法完成半胱氨酸和胱氨酸测定并与滴定法进行比较, 结果如表 1所示。
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表 1 样品分析结果(n=3) Table 1 Analytical results of the samples |
本法测得半胱氨酸、胱氨酸的回收率为97.7%和96.5%, RSD为1.6%和2.6%, 测定结果与滴定法基本一致, 表明胱氨酸片剂中辅料物质不存在干扰, 本法测定结果是可靠的。
3 结论采用简单活化处理的玻碳电极间接方波伏安法测定制剂中胱氨酸和半胱氨酸, 准确度高, 选择性好, 辅料中共存物质无干扰, [Fe(CN)6]3-还原峰电流差与半胱氨酸浓度具有良好的线性关系, 检测下限低, 操作简单。
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