2018, Vol. 38 
痔瘘熏洗剂是全国著名肛肠专家朱秉宜教授在中医外科经典著作《外科正宗》洗痔枳壳汤、起痔汤、洗痔肿痛方的基础上, 结合丰富的临床经验, 经江苏省中医院研制而成的医院制剂, 具有清热解毒、活血消肿的功效, 主要用于痔瘘脓肿疼痛、炎性感染等, 该制剂已有40余年的使用历史, 每年从中受益的病人达万人以上[1-5]。痔瘘熏洗剂由荔枝草、鱼腥草、大黄、虎杖、五倍子5味中药组成, 目前对其质量控制的研究主要是少数几个成分的定性鉴别[6], 不能全面反映其质量。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的质量分析方法, 能够较为特征地、综合地反映出中药制剂的内在整体质量, 受到国内外研究者的广泛认可, 在中药质量控制方面得到了广泛的运用[7-8]。为了更好地控制痔瘘熏洗剂的质量, 本文采用HPLC法建立痔瘘熏洗剂的特征图谱, 并同时建立了外标法测定没食子酸、咖啡酸、虎杖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、高车前草苷、白藜芦醇、高车前草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。由文献知, 以上14个单体成分具有显著的抗炎、消肿、抗菌的活性, 故对这14个成分做含量测定的研究, 以期为痔瘘熏洗剂质量控制奠定基础。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 1100高效液相色谱系统, VWD检测器, Agilent ChemStation工作站; 色谱柱为C18(4.6 mm×250 mm, 5 µm); BP-211D型电子分析天平(赛多利斯公司); SK6200H超声仪(上海科导超声仪器有限公司)。
1.2 试剂甲醇与乙腈为色谱纯, 水为超纯水, 其余试剂均为分析纯。
1.3 对照品及样品没食子酸、咖啡酸、白藜芦醇、异槲皮苷、虎杖苷、金丝桃苷、槲皮苷、高车前草苷、高车前草素、大黄酸、大黄素甲醚、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素的对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司(批号分别为160409、160710、160408、161129、160118、160627、160205、MUST-16042310、MUST-16113012、140919、141214、140522、140425、140410, 质量分数均≥98%)。
生大黄(批号20170101, 产地甘肃)、虎杖(批号20170102-02, 产地贵州)、鱼腥草(批号170301, 产地浙江)、五倍子(批号20170201, 产地四川)、荔枝草(批号170401, 产地江苏), 均购自安徽协和成药业饮片有限公司, 经南京中医药大学刘志辉教授鉴定, 分别为蓼科植物药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根和根茎、蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.的干燥根茎和根、三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的干燥地上部分、漆树科植物盐肤木Rhus chinensis Mill.叶上的虫瘿, 主要由五倍子蚜Melaphis chinensis(Bell)Bakers寄生而形成唇形科植物荔枝草Salvia plebeian R.Br.的地上部分。15批(S1~S15)痔瘘熏洗剂由江苏省中医院制剂部提供, 批号分别为1707010、1704006、1712019、1711016、1704005、1705008、1703004、1711017、1705007、1704003、1704002、1704001、1702015、1706013、1708002。各单味药以及其阴性制剂由实验室按制剂工艺自制。
2 方法与结果 2.1 溶液制备 2.1.1 混合对照品储备液精密称取没食子酸、咖啡酸、虎杖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、高车前草苷、白藜芦醇、高车前草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的对照品适量, 分别以甲醇至刻度, 制成对照品储备液(质量浓度分别为1.027 0、1.050 0、0.980 0、1.240 0、1.002 0、0.998 0、1.064 0、1.124 0、1.040 0、0.398 8、0.110 0、0.923 0、0.367 2、0.099 0 mg· mL-1); 再分别精密量取上述各储备液适量, 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 得14个成分质量浓度分别为0.065 4、0.032 2、0.2456、0.042 0、0.058 7、0.162 7、0.193 9、0.091 0、0.033 7、0.006 3、0.151 9、0.014 2、0.006 1、0.005 2 mg· mL-1的混合对照品储备液, 备用。
2.1.2 供试品溶液精密吸取样品2.5 mL, 置10 mL量瓶中, 加甲醇定容至刻度, 称量, 超声(40 kHz, 200 W)30 min, 放冷, 称量, 用甲醇补足减失的量, 摇匀, 过0.45µm微孔滤膜, 即得。
2.2 色谱条件与系统适用性试验采用Agilent 1100高效液相色谱系统, VWD检测器, Agilent Chem Station工作站。色谱柱: Hedera-ODS-2 C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 µm); 流动相: 0.1%磷酸(A)-乙腈(B), 梯度洗脱(0~5 min, 5%B; 5~10 min, 5%B→8%B; 10~20 min, 8%B→15%B; 20~50 min, 15%B→26%B; 50~65 min, 26%B→43%B; 65~75 min, 43%B→60%B; 75~80 min, 60%B→80%B; 80~85 min, 80%B; 85~90 min, 80%B→5%B; 90~95 min, 5%B); 流速: 1.0 mL·min-1; 柱温: 25 ℃; 进样量: 10 µL; 紫外检测波长: 330 nm(0~30 min), 256 nm(31~95 min)。按“2.1”项下方法分别制备供试品溶液、缺大黄的阴性溶液、缺虎杖的阴性溶液、缺五倍子的阴性溶液、缺鱼腥草的阴性溶液、缺荔枝草的阴性溶液、缺大黄和虎杖的双阴性溶液, 精密吸取10 µL进样, 记录色谱图, 上述阴性溶液在色谱图相应位置上无干扰峰出现。色谱图见图 1。
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1.没食子酸(gallic acid) 2.咖啡酸(caffeic acid) 3.虎杖苷(polydatin) 4.金丝桃苷(hyperoside) 5.异槲皮苷(isoquercitrin) 6.槲皮苷(quercitrin) 7.高车前草苷(homoplantaginin) 8.白藜芦醇(resveratrol) 9.高车前素(hispidulin) 10.芦荟大黄素(aloe emodin) 11.大黄酸(rhein) 12.大黄素(emodin) 13.大黄酚(chrysophanol) 14.大黄素甲醚(emodin methyl ether) 图 1 混合对照品(A)、样品(B)、缺虎杖阴性样品(C)、缺五倍子阴性样品(D)、缺大黄阴性样品(E)、缺大黄和虎杖阴性样品(F)、缺荔枝草阴性样品(G)、缺鱼腥草阴性样品(H)色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A), Zhilou lotion(B), negative sample without Polygoni cuspidati Rhizoma et Radix(C), negative sample without Galla chinensis(D), negative sample without Rhei Radix et Rhizoma(E), negative sample without Rhei Radix et Rhizoma and Polygoni cuspidati Rhizoma et Radix(F), negative sample without Salvia plebeian(G), negative sample without Houttuyniae Herba(H) |
同“2.2”项下。
2.3.2 供试品溶液的制备同“2.1.2”项下。
2.3.3 精密度试验精密吸取编号为S1(批号1707010)的痔瘘熏洗剂2.5 mL, 按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液, 精密吸取10 µL, 按“2.2”项下色谱条件连续进样6次进行测定, 记录峰面积。以分离度较好, 峰面积大, 为各批次样品所共有的虎杖苷为参照峰, 计算各共有峰相对峰面积的RSD, 结果均小于5.5%, 说明仪器精密度良好。用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A版)进行分析, 计算得色谱图之间的相似度为1, 符合中药特征图谱的要求。
2.3.4 稳定性试验精密吸取编号为S1(批号1707010)的痔瘘熏洗剂2.5 mL, 按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液, 精密吸取10 µL, 按“2.2”项下色谱条件, 分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定, 记录峰面积。以虎杖苷为参照峰, 计算各共有峰相对峰面积的RSD < 4.3%, 供试品溶液在24 h内稳定。用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A版), 计算得各色谱图之间的相似度为1, 符合中药特征图谱的要求。
2.3.5 重复性试验精密吸取编号为S1(批号1707010)的痔瘘熏洗剂2.5 mL, 平行6份, 按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液, 精密吸取10 µL, 按“2.2”项下色谱条件进样测定, 记录峰面积。以虎杖苷为参照峰, 计算各共有峰相对峰面积的RSD < 4.5%, 表明该方法重复性好。用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A版)进行分析, 计算得色谱图之间的相似度为1, 符合中药特征图谱的要求。
2.3.6 特征图谱的建立按“2.1”项下方法制备15批样品的供试品溶液, 精密吸取10 µL, 按“2.2”项下色谱条件进样, 记录色谱图, 导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A版)。选取S1的色谱图为参照图谱, 生成痔瘘熏洗剂的对照特征图谱, 见图 2, 15批痔瘘熏洗剂的HPLC特征图谱匹配图见图 3。共确定了26个共有峰, 指认出14个色谱峰, 以虎杖苷为参照峰, 计算15批样品与对照特征图谱的相似度, 结果见表 1, 显示相似度均大于0.98。
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1.没食子酸(gallic acid) 4.咖啡酸(caffeic acid) 6.虎杖苷(polydatin) 7.金丝桃苷(hyperoside) 8.异槲皮苷(isoquercitrin) 10.槲皮苷(quercitrin) 12.高车前草苷(homoplantaginin) 14.白藜芦醇(resveratrol) 18.高车前素(hispidulin) 19.芦荟大黄素(aloe emodin) 20.大黄酸(rhein) 21.大黄素(emodin) 22.大黄酚(chrysophanol) 23.大黄素甲醚(emodin methyl ether) 图 2 痔瘘熏洗剂的对照特征图谱 Figure 2 Common pattern of the characteristic chromatogram of Zhilou lotion |
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图 3 15批痔瘘熏洗剂特征图谱 Figure 3 The characteristic chromatograms of 15 batches of Zhilou lotion |
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表 1 15批痔瘘熏洗剂特征图谱与对照特征图谱的相似度计算结果 Table 1 Similarities of characteristic chromatogram and control characteristic chromatogram of 15 batches of Zhilou lotion |
按“2.1.2”项下方法制备各单味饮片供试溶液, 精密吸取10 µL, 按“2.2”项下色谱条件进样测定, 结果见图 4。试验结果表明, 部分共有峰在相应的饮片中能对应, 1、3、5、9、11、13号峰为五倍子饮片中的成分, 9号峰归属是五味子的鞣质的混合成分, 由Waters多波长扫描发现, 该峰有较多的最大吸收波长, 且峰纯度检测发现峰不纯, 故确定该峰为1个混合物; 2、7、8、10号峰为鱼腥草饮片中的成分, 6、14、16、17、21、23号峰为虎杖饮片中的成分, 15、17、19、20、21、22号峰为大黄饮片中的成分, 4、12、18为荔枝草饮片中的成分。其中19、20、21、22、23是大黄和虎杖共有的成分, 但由于有些成分含量较低, 在标尺一致的情况下, 有些峰无法显现。但如果将标尺缩小, 则可以显现。
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S1.痔瘘熏洗剂(Zhilou lotion) S2.五倍子(Galla chinensis) S3.鱼腥草(Houttuyniae Herba) S4.荔枝草(Salvia plebeian) S5.虎杖(Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix) S6.大黄(Rhei Radix et Rhizoma) 图 4 痔瘘熏洗剂及各单味药图谱 Figure 4 The chromatograms of Zhilou lotion and single herbal medicine |
以15个痔瘘熏洗剂特征图谱的23个共有峰面积为指标, 得到15×23矩阵, 采用SPSS 2.0软件进行聚类分析, 选用组间均联法(average link age between groups), 以Euclidean距离为度量标准聚类分析, 结果如图 5所示。15个样品可以分为两类, S1和S15为一类, 其余分为一类, 批号不同的合格饮片生产的产品其所含成分含量会存在差异, 同一批号的饮片生产的产品其所含成分也会存在差异, 不同的成分差异也不一样。不同成分及同一类成分的不同含量其药效可能受影响(为此, 我们正在研究工艺过程的评价方法, 特别是与药效相关联), 因此, 多成分的含量测及分析定可为此奠定一定的基础。
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图 5 15个批号的痔瘘熏洗剂聚类分析图 Figure 5 Cluster analysis of 15 Zhilou lotion samples |
分别精密吸取混合对照品储备液适量, 稀释为1、2、4、8、16和32倍的混合对照品溶液, 精密吸取各混合对照品溶液10 µL, 依法进样, 以测得的响应信号峰面积和被测物的进样浓度用最小二乘法进行线性回归, 得到各成分的回归方程以及线性范围, 见表 2。结果表明, 待测成分在各自的浓度范围内有良好的线性关系。
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表 2 14种成分的线性回归方程、相关系数(r)及线性范围 Table 2 Regression equation and linear ranges of 14 components |
分别精密吸取同一混合对照品溶液10 µL注入液相色谱仪, 连续进样6次进行测定。按峰面积计算, 没食子酸、咖啡酸、虎杖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、高车前草苷、白藜芦醇、高车前草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD分别为3.2%、2.9%、3.4%、3.3%、2.6%、3.1%、3.2%、3.4%、1.2%、3.4%、3.3%、3.4%、0.87%、2.1%, 结果表明仪器精密度良好。
2.4.3 重复性试验取同一批号(1707010)的痔瘘熏洗剂6份, 分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液, 进样测定峰面积, 计算样品中没食子酸、咖啡酸、虎杖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、高车前草苷、白藜芦醇、高车前草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量分别为0.701 4、0.007 3、0.186 9、0.023 7、0.031 3、0.030 7、0.587 7、0.018 3、0.013 8、0.003 8、0.060 0、0.008 9、0.002 9、0.0016 mg·mL-1, RSD分别为3.1%、0.72%、1.7%、3.7%、3.9%、2.3%、3.1%、0.44%、3.7%、3.0%、3.2%、3.6%、1.2%、0.49%, 结果表明该方法的重复性良好。
2.4.4 加样回收率试验取已知含量的同一批号(1707010)的痔瘘熏洗剂6份, 分别精密加入没食子酸、咖啡酸、虎杖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、高车前草苷、白藜芦醇、高车前草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的混合对照品溶液适量, 并按“2.1.2”项下方法制备供试溶液, 进样测定, 计算回收率, 结果(表 3)表明该方法的准确度良好。
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表 3 14个成分的加样回收率(n=6) Table 3 The recoveries of fourteen components in samples |
取批号为1707010的样品2.5 mL, 按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液, 分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样, 测定供试品溶液中没食子酸、咖啡酸、虎杖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、高车前草苷、白藜芦醇、高车前草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积, 计算RSD。结果上述各待测成分峰面积的RSD分别为4.1%、1.9%、3.1%、2.7%、4.9%、3.1%、5.2%、5.4%、3.0%、4.6%、4.3%、0.5%、3.0%、2.0%。表明24 h内供试品溶液的稳定性良好。
2.4.6 样品含量测定取15批痔瘘熏洗剂样品, 按“2.1”项下方法制备供试品溶液, 按“2.2”项下色谱条件进样测定, 采用外标法计算含量, 结果见表 4。
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表 4 15批样品中14个成分含量测定结果(mg·mL-1) Table 4 Contents of 14 components in fifteen batches of samples |
痔瘘熏洗剂由大黄、虎杖、五倍子、荔枝草、鱼腥草5味中药组成:大黄主要含有蒽醌类(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)和蒽酮类成分等[9]; 虎杖主要含有蒽醌类成分和二苯乙烯类成分(虎杖苷, 白藜芦醇)等[10]; 五倍子主要含有鞣质类成分和没食子酸等[11]; 鱼腥草主要含有挥发性成分和黄酮类成分(金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷)等[12]; 荔枝草主要含有黄酮类成分(高车前苷, 高车前素)等[13]。据文献报道[14-18], 上述成分多采用HPLC分析, 并且进行梯度洗脱。为了全面控制痔瘘熏洗剂的内在质量, 笔者结合2015年版《中华人民共和国药典》 [19], 测定各单味药特征性的有效成分, 对没食子酸、咖啡酸、虎杖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、高车前草苷、白藜芦醇、高车前草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量进行测定。由文献可知[20-25], 以上14个成分具有显著的抗炎、杀菌、消肿的作用, 与痔瘘熏洗剂治疗痔疮脓肿疼痛的作用关联很大, 故对这14个成分进行了含量测定。图 2-B中, 峰号为9的色谱峰归属是五味子的混合成分, 由Waters多波长扫描发现, 该峰有较多的最大吸收波长, 且峰纯度检测发现峰不纯, 故确定该峰为1个混合物。由文献可知, 该成分可能是五倍子鞣质, 五倍子的鞣质含量很高, 最高可达70%以上, 并且五倍子鞣质的化学成分许多还存在异构体, 在简单的液相条件下很难分开, 故本文未对图 2-B中的9号峰进行含量测定[26], 后期实验室会结合大孔树脂、微波萃取等分离技术, 对该混合成分进行分离并深入研究。以制剂的各饮片中已有报道的有效成分或指标成分为目标成分, 加上用单味饮片则更突显其特征, 即每个饮片都能找到2个以上特有的对应峰, 并至少有1个有化学对照品进行指认, 使定性和定量显得更有意义。
3.2 色谱条件的选择考察不同流动相(乙腈-0.1%磷酸水, 甲醇-0.1%磷酸水, 甲醇-0.1%醋酸水, 乙腈-0.1%甲酸水), 结果采用乙腈-0.1%磷酸水, 目标峰的峰形与分离度均较好, 基线平稳, 故选择其作为流动相。
3.3 色谱条件耐用性本试验采用不同仪器(Agilent 1260高效液相色谱仪、Waters 2695-2996高效液相色谱仪、Agilent 1100高效液相色谱仪)、不同品牌色谱柱(Amethyst C18-H、Hederal ODS-2、Elite C18)、不同流速(0.9、1.0、1.1 mL·min-1)、不同温度(25、30、35 ℃), 在这些条件组合下实验, 结果表明, 上述14个成分在不同仪器、不同色谱柱、不同流速及不同温度条件下分离度良好, 对上述14个成分的分离度无明显影响。说明该色谱条件耐用性良好。
3.4 结论综上所述, 本实验建立了痔瘘熏洗剂的特征图谱, 共有23个共有峰, 方法学考察符合要求。通过特征图谱与单味药以及对照品进行相关性对比, 对部分色谱峰进行了归属, 并用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A版)进行相似度分析, 15批制剂的相似度均大于0.98, 结果表明15批制剂间相似度高, 所建立的特征图谱能较全面地反映制剂中的整体物质。同时建立了没食子酸、咖啡酸、虎杖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、高车前草苷、白藜芦醇、高车前草素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的测定方法, 为痔瘘熏洗剂的质量控制及深入研究奠定了基础。
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