2018, Vol. 38 
川射干为鸢尾科植物鸢尾Iris tectorum Maxim.的干燥根茎，具有清热解毒、祛痰、利咽的功效，用于热毒痰火郁结、咽喉肿痛、痰涎壅盛、咳嗽气喘[1]。其药材长期以来主要依靠采集野生资源，来源广泛，主产于四川、重庆、贵州、云南、广西等省，不同生长环境下的川射干质量参差不齐，市场上饮片更是鱼目混杂，故对川射干进行质量控制尤为重要。川射干的化学成分主要包括黄酮类化合物及其糖苷、异黄酮类化合物及其糖苷、苯醌类化合物、三萜类化合物及其皂苷，其中异黄酮类化合物是鸢尾属植物的特征性化学成分[2-5]，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗骨质疏松、神经保护作用等[6-12]。《中华人民共和国药典》对川射干含量规定仅为HPLC法测定射干苷，难以全面反映其真实质量。本文参考文献[13-14]，采用HPLC法，在同一条件下同时测定药材中射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾苷元、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B的含量，较全面地检测了其异黄酮主要成分，并根据测定所得含量结果，对数据进行聚类分析[15]，反映不同产地川射干药材异黄酮类成分的区别。该方法简便可行，为川射干种植、栽培和质量评价及控制提供科学依据。
1 仪器与试药1100型高效液相色谱仪（安捷伦公司）；Sartorius BP 211D型电子天平（十万分之一，赛多利斯公司）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）；Millipore Milli Q Integral 3超纯水机（默克密理博公司）。
对照品：射干苷（中国食品药品检定研究院，批号111632-200501）；野鸢尾苷（江苏永健医药科技有限公司，批号151228，纯度大于98.0%）；射干苷元（成都曼思特生物制品有限公司，批号MUST-14091601，纯度大于98.0%）；鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B（自制，HPLC峰面积归一化法测定纯度均大于98.0%）。
甲醇为色谱纯（用于配制流动相，Fisher公司）和分析纯（用于制备对照品溶液，成都市科龙化工试剂厂），乙醇及冰醋酸为分析纯（成都市科龙化工试剂厂），水为超纯水。
川射干购于四川、重庆、贵州、云南、广西等地，由四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定为鸢尾科植物鸢尾Iris tectorum Maxim.的干燥根茎。
2 方法与结果 2.1 混合对照品溶液的制备精密称取射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾苷元、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B的对照品适量，加70%甲醇水配制成每1 mL含射干苷0.049 6 mg，鸢尾甲苷A 0.007 2 mg，鸢尾甲苷B 0.011 8 mg，野鸢尾苷0.008 8 mg，鸢尾苷元0.032 4 mg，鸢尾甲黄素A 0.011 0 mg，鸢尾甲黄素B 0.011 4 mg的混合溶液，即得。
2.2 供试品溶液的制备取川射干粉末（过3号筛）约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇水25 mL，密塞，称量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）1 h，放冷，再称量，用70%乙醇水补足减失的量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL，置10 mL量瓶中，加70%乙醇水稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3 色谱条件和系统适用性试验色谱柱：Kromasil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温：35 ℃；流动相：甲醇-0.5%醋酸水，梯度洗脱（0 min，30%甲醇；20 min，30%甲醇；27 min，38%甲醇；65 min，38%甲醇）；流速：1 mL·min-1；检测波长：266 nm。按照上述色谱条件，取混合对照品溶液和5号样品（四川青神）的供试品溶液分别进样10 μL进行分析，色谱图见图 1。
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1.射干苷（tectoridin）2.鸢尾甲苷A（iristectorin A）3.鸢尾甲苷B（iristectorin B）4.野鸢尾苷（iridin）5.鸢尾苷元（tectorigenin）6.鸢尾甲黄素A（iristectorigenin A）7.鸢尾甲黄素B（iristectorigenin B） 图 1 对照品（A）及5号样品（B）色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sample No. 5(B) |
精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液0.5、1、2、5、10、15、20 μL，按照上述色谱条件进样测定；以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，计算回归方程，结果见表 1。
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表 1 线性关系试验结果 Table 1 Results of linear relation test |
精密吸取5号样品的供试品溶液10 μL，按上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积；结果射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾苷元、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B峰面积的RSD（n=6）分别为0.62%、0.82%、0.89%、0.77%、0.76%、0.94%、1.0%，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验精密吸取5号样品的供试品溶液10 μL，室温下分别于0、2、4、6、12、24 h进样测定，记录峰面积；结果射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾苷元、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B峰面积的RSD（n=6）分别为0.72%、0.91%、0.84%、0.92%、0.85%、1.0%、1.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.7 重复性试验取同一批川射干（5号样品）粉末6份，每份0.25 g，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样10 μL，记录峰面积，计算含量及其RSD；射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾苷元、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B平均含量（n=6）分别为46.45、6.02、9.24、6.41、12.56、3.24、7.13 mg·g-1，RSD分别为0.75%、1.8%、1.4%、1.3%、0.98%、1.4%、1.6%。
2.8 加样回收率试验取已知含量的川射干（5号样品）约0.125 g，共6份，精密称定，分别精密加入含射干苷0.232 1 mg·mL-1，鸢尾甲苷A 0. 031 9 mg·mL-1，鸢尾甲B 0.046 2 mg·mL-1，野鸢尾苷0.032 1mg·mL-1，鸢尾苷元0.062 5 mg·mL-1，鸢尾甲黄素A 0.016 7 mg·mL-1，鸢尾甲黄素B 0.035 7 mg·mL-1的混合对照品的70%乙醇溶液25 mL，按照“2.2”项下方法制备供试溶液，进样10 μL，计算回收率；结果射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾苷元、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B平均回收率（n=6）分别为99.7%（RSD=0.57%）、97.7%（RSD =2.0%）、98.2%（RSD=1.3%）、98.2%（RSD=1.1%）、98.8%（RSD=0.81%）、103.0%（RSD=2.2%），103.6%（RSD =2.3%）。
2.9 检测下限与定量下限按“2.3”项色谱条件进样10 μL，取基线噪声的3倍值时测得的量作为检测下限，基线噪声的10倍值时测得的量作为定量下限；结果射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷检测下限约为0.23 ng，定量下限约为0.77 ng；鸢尾苷元、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素检测下限测约为0.19 ng，定量下限约为0.63 ng。
2.10 样品测定结果取川射干粉末约0.25 g，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项色谱条件进样10 μL，测定15批不同产地川射干中射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾苷元、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B的含量，记录峰面积，采用外标法计算各样品中各成分的含量平均值，结果见表 2。
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表 2 样品含量测定结果（n=2） Table 2 Results of content determination of samples |
使用SPSS 19.0软件对15批不同产地川射干样品的7个指标性异黄酮成分的含量进了系统聚类分析，结果见图 2。15批样品一共分为两大类，其中样品1~5为第2大类，其余10个样品为第1大类。随着阈值的减少，15批样品又可分为A、B、C三大类，三部分能够明显区分开。第1大类随着阈值的减小继续分为A、B两大类，其中样品7~8号属于B大类，其余样品属于A大类；第2大类分为两类，其中2号及4号样品属于一类，其余属于一类。结果显示样品中7份指标成分含量相近的样品被聚在一起。也有部分产地相近的样品被聚在一类，如A大类中12号及13号样品被分在一组，这2批样品均来之贵州产地；B大类中7号及8号样品被分在一组，这2批样品均来自重庆产地。
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图 2 15批不同产地川射干样品聚类分析图 Figure 2 The dendrogram of 15 samples from different habitats |
流动相系统考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水（含冰醋酸）、乙腈-水（含冰醋酸），结果不加冰醋酸的系统，苷元部分拖尾严重，影响分离效果，加冰醋酸的系统分离效果良好，考虑成本，选择甲醇-水（含冰醋酸）为流动相溶剂。由于所有成分均为异黄酮化合物，紫外吸收基本一致，最大吸收均为266 nm，所以采用266 nm作为检测波长。
3.2 提取方法考察药材提取考察了不同提取溶剂如甲醇、乙醇、50%乙醇水、70%乙醇水，考察了不同的提取方法如水浴回流、渗滤、超声，同时还考察了不同提取时间如30、45、60、90 min。结果表明，采用《中华人民共和国药典》方法[1]为佳，即采用70%乙醇水为提取溶剂，超声提取1 h，异黄酮成分基本提取完全，色谱峰数量及响应值均不再增加，工艺简单易操作。
3.3 结论通过含量测定及聚类分析结果可以看出，不同产地川射干之间异黄酮成分存在不同差异，四川地区的样品黄酮苷元部分含量较高，云南、贵州地区的样品黄酮苷部分含量较高，这可能与产地气候、土壤、海拔等有一定关系，都可能在一定程度上反映川射干内在质量，更加接近川射干异黄酮成分真实情况，为川射干的种植、栽培提供了理论依据。
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