2018, Vol. 38 
2. 江西省药品检验检测研究院, 江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心, 南昌 330029
2. Jiangxi Institute for Drug Control, Jiangxi Provincial Engineering Research Center for Drug and Medical Device Quality, Nanchang 330029, China
排石颗粒是由连钱草、盐车前子、木通、徐长卿、石韦、忍冬藤、滑石、瞿麦、苘麻子、甘草10味中药加工制成的复方制剂[1-2]。具有清热利水及通淋排石的功效，临床用于治疗下焦湿热所致的石淋，症见腰腹疼痛，排尿不畅或伴有血尿，泌尿系结石等症状[3-4]，疗效较好[5-7]。该药标准收载于《中华人民共和国药典》2015版一部[8]。现有标准项目有性状、熊果酸薄层色谱鉴别及总黄酮含量测定，其检测项目专属性较差。连钱草是方中君药，文献报道连钱草中酚酸类化合物有利于减少草酸钙沉积，有效抑制结石的形成，使尿液变成酸性而溶解化散结石，同时改善组织细胞的代谢和功能，加速尿液排放，促进微结石排出体外[9]，因此，酚酸类化合物是连钱草排石的主要活性成分，迷迭香酸、丹酚酸A和咖啡酸为连钱草中主要的酚酸类化合物，其中丹酚酸A在抗氧化，抗肺纤维化，抗肿瘤，心肌缺血保护，神经保护和防治糖尿病及并发症等多方面有着显著的药理活性和药效作用[10]。咖啡酰甘醇酸（caffeoylglycolic acid）为一种天然的酚类化合物，具有抗炎活性[11-12]。迷迭香酸具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等多种生物活性[13]。已有文献报道采用高效液相色谱法测定连钱草或排石颗粒中迷迭香酸的含量[14-15]，但同时测定排石颗粒中连钱草的3个酚酸成分未见报道，本研究采用高效液相色谱法对排石颗粒中3个酚酸类活性成分咖啡酰甘醇酸、迷迭香酸和丹酚酸A进行了含量测定，在样品中的3个成分可以达到完全分离，测定方法准确，专属性好，为评价和控制排石颗粒的质量提供科学的依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括G1311C四元泵、在线脱气机、G1315D DAD、G1329B自动进样器、LC1260色谱工作站、G1316A柱温箱；Sartorius BT25S电子天平（十万分之一），Sartorius BSA124S-CW电子天平（万分之一）。
1.2 试药对照品咖啡酰甘醇酸和丹酚酸A为本课题组自制，通过1H-NMR、13C-NMR、MS等手段确证了其结构，经HPLC法检测，纯度 > 98%（面积归一法）；迷迭香酸对照品（批号111871-201414）购自中国食品药品检定研究院，纯度 > 98%。水为娃哈哈饮用纯净水，乙腈（Sigma公司）为色谱纯，甲醇及乙醇（上海振兴化工一厂）、甲酸（西陇科学股份有限公司）为分析纯。13批排石颗粒样品以及连钱草药材和缺连钱草的阴性样品均由江西济生制药厂提供。
2 溶液的制备 2.1 混合对照品溶液取咖啡酰甘醇酸、迷迭香酸和丹酚酸A的对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为26.75、261.80和10.18 μg·mL-1的混合溶液，即得。
2.2 供试品溶液取排石颗粒粉末（过3号筛）约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇水50 mL，密塞，称量，加热回流1 h，放冷，再称量，用70%乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸干，残渣加30 mL水使溶解，置于分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取4次，每次40 mL，收集乙酸乙酯部分，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。
2.3 连钱草药材溶液取连钱草药材粉末（过2号筛）约1 g，精密称定，同供试品溶液制备方法制得连钱草药材溶液。
2.4 阴性样品溶液取缺连钱草的阴性样品粉末（过3号筛）约10 g，精密称定，同供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。
3 色谱条件色谱柱：Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~15 min，20%A；15~20 min，20%A→25%A；20~25 min，25%A；25~30 min，25%A→31%A；30~45 min，31%A）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：330 nm；进样量：10 μL；分析时间：45 min；样品色谱中与各对照品对应的吸收峰的理论板数均不低于3 000。在上述色谱条件下，色谱图见图 1。
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1.咖啡酰甘醇酸（caffeoylglycolic acid）2.迷迭香酸（rosmarinic acid）3.丹酚酸A（salvianolic acid A） 图 1 混合对照品（A）、排石颗粒样品（B）、连钱草药材（C）和缺连钱草阴性样品（D）色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances(A), Paishi granules sample(B), Glechomae Herba(C)and negative sample without Glechomae Herba(D) |
精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，分别按“3”项下色谱条件进样分析，以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归处理。得咖啡酰甘醇酸、迷迭香酸和丹酚酸A的回归方程：
| $ \begin{array}{l} Y = 4360.4810X - 1.2150\;\;\;\;r = 0.9999\\ Y = 2876.6229X - 10.4323\;\;\;r = 0.9999\\ Y = 4135.4211X - 2.0122\;\;\;r = 0.9999 \end{array} $ |
结果表明，咖啡酰甘醇酸、迷迭香酸和丹酚酸A进样量分别在0.026 8~0.535 0、0.261 8~5.236 0和0.010 2~0.203 6 μg范围内与峰面积呈现良好的线性关系。
4.2 精密度试验精密吸取混合对照品溶液10 μL，按“3”项下色谱条件连续进样6次，依次测定峰面积。结果咖啡酰甘醇酸、迷迭香酸和丹酚酸A峰面积的RSD（n=6）分别为0.33%、0.22%和0.38%，表明仪器精密度良好。
4.3 稳定性试验精密吸取供试品溶液10 μL，按“3”项下色谱条件，在24 h内于0、1、2、4、8、12、24 h分别进样测定，结果咖啡酰甘醇酸、迷迭香酸和丹酚酸A峰面积的RSD（n=7）分别为0.49%、0.83%和1.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
4.4 重复性试验取同一批排石颗粒粉末（过3号筛）6份，各约10 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“3”项下色谱条件进样测定，测得咖啡酰甘醇酸、迷迭香酸和丹酚酸A平均含量（n=6）分别为23.98、258.06和12.07 μg·g-1，RSD分别为0.55%、0.63%和0.71%。
4.5 回收率试验精密称取“4.4”项下已知含量的排石颗粒粉末（过3号筛）6份，每份约5 g，精密称定，每份分别精密加入含咖啡酰甘醇酸（2.568 μg·mL-1）、迷迭香酸（25.720 μg·mL-1）和丹酚酸A（1.222 μg·mL-1）的混合对照品溶液50 mL，按“2.2”项下方法制备供试溶液，并按“3”项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果咖啡酰甘醇酸、迷迭香酸和丹酚酸A的平均回收率（n=6）分别为95.6%、99.0%和97.6%，RSD分别为1.1%、1.1%和1.4%。
4.6 色谱柱耐用性试验取同一批排石颗粒粉末（过3号筛）约10 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别采用SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3种品牌的色谱柱，按“3”项下色谱条件进行测定，结果无明显差别。
5 样品含量测定分别取不同批次的排石颗粒粉末（过3号筛），每批样品取2份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“3”项下色谱条件进行分析，测定峰面积，用外标法计算出咖啡酰甘醇酸、迷迭香酸和丹酚酸A的含量，结果见表 1。
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表 1 样品含量测定结果（μg·g-1，n=2） Table 1 Results of concent determination of samples |
应用DAD检测器在190~400 nm范围内对咖啡酰甘醇酸、迷迭香酸和丹酚酸A进行光谱扫描；结果表明，在330 nm波长附近3个酚酸素类成分均有最大吸收，干扰少且稳定，故选择330 nm作为检测波长。
6.2 提取方式的考察提取方法考察了回流提取法和超声提取法对咖啡酰甘醇酸、迷迭香酸和丹酚酸A含量测定的影响；结果显示，回流提取法提取更完全，故选择回流提取法；提取溶剂考察了水、甲醇溶液（30%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液、甲醇）、乙醇溶液（30%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液、70%乙醇水溶液、95%乙醇水溶液），结果显示，采用70%乙醇水溶液提取时3个酚酸类含量均较高；提取时间考察了0.5、1、1.5 h，结果显示1 h可提取完全；提取溶剂的体积考察了50、100 mL，结果显示无差别，故将提取体积定为50 mL。
6.3 流动相的确定考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液4个溶剂系统；结果显示，以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，所得色谱峰峰形较好，分离效果最佳。
6.4 小结本实验通过对13批排石颗粒中咖啡酰甘醇酸、迷迭香酸和丹酚酸A 3个酚酸类成分的含量进行测定，结果显示，各批次含量有一定差异，可能与连钱草药材的产地和采收时间有关；比较迷迭香酸的含量，发现批次越新，含量相对越高，可能与迷迭香酸的稳定性有关，需要对其进一步进行长期实验的研究。本实验所建立的定量方法的色谱峰分离效果较好，基线较平，重复性较好，为进一步完善排石颗粒的质量评价方法提供参考依据。
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