2018, Vol. 38 
银屑病是一种常见的易于复发的慢性炎症性皮肤病，特征性损害为红色丘疹或斑块上覆有多层银白色鳞屑[1-2]。该类病以关节炎、肌腱端炎、脊柱炎和银屑病皮疹为主要表现的疾病，临床表现和疾病进程多样化[3-5]。传统治疗银屑病的药物包括甲氨蝶呤、环孢素、维甲酸类药物等，这些药物各有不同程度的疗效，但不良反应也多[6-7]。此外，患有重度银屑病的患者多数有各种并发症，如非酒精性脂肪肝、缺血性心脏病等[8]，这也一定程度上限制了治疗药物的选择范围。
中国医学科学院药物研究所经多年研究，找到了全新结构的高选择性S1P1受体激动剂艾托莫德（SYL927）[9-10]，化学结构及名称见表 1。SYL927体外药理实验表现出对S1P1受体显著的激动活性和选择性；在体内，该药物通过诱导外周循环淋巴细胞归巢作用，能够在不降低心率的同时有效降低大鼠外周血淋巴细胞水平，在自身免疫性疾病银屑病模型中发挥良好的治疗作用[11-13]。此外，与其他S1P受体激动剂相比，SYL927选择性激动S1P1受体，而对心肌细胞上分布较广的S1P3受体亚型作用微弱，对心脏副作用小；且其半衰期短，对淋巴细胞的转运展现出更为有效和快速可逆的抑制作用[14]。SYL927具有良好的药理活性和较低的毒副作用，代谢特性良好[15]，作为用于治疗银屑病的1类新药，正在进行Ⅰ期临床研究。
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表 1 SYL927及有关物质的结构 Table 1 Structures of SYL927 and related substances |
唑-4-基)-[1, 1′-联苯]-4-基)乙基}-1, 3-丙二醇盐酸盐2-amino-2-(2-(4′-(2-ethyloxazol-4-yl)-[1, 1′-biphenyl]- 4-yl)ethyl)-1, 3-propanediol hydrochloride
为控制SYL927原料药在合成过程中可能存在的中间体、副产物等有关物质，本文建立了采用高效液相色谱法检测SYL927的有关物质的方法，对原料药合成工艺中的6种中间体（927-1、927-2、927-3、927-5、927-6、927-7，结构及名称见表 1）和3种副产物（Imp-A、Imp-C、Imp-F，结构及名称见表 1）进行了研究，通过专属性、破坏性、耐用性等试验及方法学验证，从而为监测原料药有关物质，保证药物的质量提供可靠的方法。
1 仪器与试药 1.1 仪器岛津高效液相色谱仪（岛津LC-20AT泵、SPD-M20A检测器、LC solution工作站），XP205十万分之一电子天平（METTLER公司）。
1.2 试药乙腈、甲醇均为HPLC级，百灵威公司；水为市售娃哈哈纯净水；三水合乙酸钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙酸，分析纯，北京化工厂。艾托莫德（SYL927）原料药样品（批号SNT20140423、SNT20140424、SNT20140425），中国医学科学院药物研究所；SYL927，合成中间体927-1、927-2、927-3、927-5、927-6、927-7和副产物Imp-A、Imp-C、Imp-F的对照品，纯度均大于99%，由中国医学科学院药物研究所合成和标化。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱：Agilent HC-C8（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A相为乙腈，B相为0.2%醋酸钠缓冲液（称取三水合醋酸钠20.4 g，加冰醋酸80 mL，加水至1 000 mL，加水稀释10倍，pH 3.6），进行梯度洗脱，梯度洗脱程序见表 2；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃；检测波长：283 nm；进样量：20 μL。
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表 2 梯度洗脱程序 Table 2 Gradient elution program |
取SYL927原料药样品约25 mg，准确称量，置25 mL量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为1 mg·mL-1的溶液，即得。
2.3 混合对照溶液的制备精密量取供试品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得10 μg·mL-1的溶液，即得。
2.4 混合对照品溶液的制备分别称取SYL927及中间体927-1、927-2、927-3、927-5、927-6、927-7适量，加甲醇溶解并定量稀释制成10 μg·mL-1的混合对照品溶液Ⅰ。分别称取副产物Imp-A、Imp-C、Imp-F和中间体927-7，加甲醇溶解并定量稀释制成10 μg·mL-1的混合对照品溶液Ⅱ。
2.5 专属性试验量取空白溶剂、混合对照品溶液Ⅰ、混合对照品溶液Ⅱ、供试品溶液各20 μL，按“2.1”项的色谱条件进样测定。结果表明，溶剂不干扰各化合物的分离，SYL927与9个有关物质与各相邻峰均达到完全分离，分离度大于1.5，专属性好，见图 1。
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A.空白溶剂（blank solvent）B.混合对照品溶液Ⅰ（mixed reference substance solution Ⅰ）C.混合对照品溶液Ⅱ（mixed reference substance solution Ⅱ）D.供试品溶液（analytical solution） 图 1 专属性色谱图 Figure 1 Chromatograms of specificity |
称取SYL927原料药样品约10 mg，共5份，分别进行光照[置于（4 500±500）lx，10 d]、高温加热（60 ℃，10 d）、碱破坏（加6 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL，在80 ℃水浴加热1 h，放冷至室温，加6 mol·L-1盐酸溶液中和）、酸破坏（加6 mol·L-1盐酸溶液1 mL，在80 ℃水浴加热1 h，放冷至室温，加6 mol·L-1氢氧化钠溶液中和）、氧化破坏（加入30%过氧化氢溶液1 mL，80 ℃水浴0.5 h），加甲醇制成0.2 mg·mL-1的破坏溶液，同法配制各破坏条件的空白溶液。分别精密量取上述破坏溶液各20 μL，按“2.1”项色谱条件测定，色谱图见图 2。
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a.供试品溶液（analytical solution）b.高温破坏溶液（thermolytic condition solution）c.光破坏溶液（photolytic condition solution）d.碱破坏溶液（basic hydrolysis solution）e.酸破坏溶液（acidic hydrolysis solution）f.氧化破坏溶液（oxidative solution） 图 2 SYL927破坏试验色谱图 Figure 2 Chromatograms of stress condition test |
结果表明，SYL927在光照、高温加热、碱破坏条件下稳定，未产生新杂质；酸破坏分解产生少量杂质；在氧化条件下不稳定，氧化分解产生较多杂质。SYL927经过破坏所产生的杂质与主峰及各杂质峰之间也能完全分离，分离度大于1.5；证明建立的方法专属性好，可用于SYL927的有关物质测定。
2.7 线性关系考察及响应因子、检测下限与定量下限测定称取SYL927、6种中间体和3种副产物的对照品适量，分别加甲醇溶解并定量稀释制成0.1~22 μg·mL-1的6个系列浓度混合对照品溶液，在“2.1”项的色谱条件下进样测定；以质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，10种化合物线性关系良好。计算各中间体和副产物相对SYL927的响应因子，以S/N=3时测得量为检测下限，S/N=10时测得量为定量下限。结果见表 3。
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表 3 SYL927及9个有关物质的线性范围、回归方程、响应因子、检测下限（LOD）与定量下限（LOQ） Table 3 Linear ranges, regression equations, response factors, detection limits(LOD) and quantitation limits(LOQ)of SYL927 and 9 related substances |
称取SYL927、927-1、927-2、927-3、927-5、927-6、927-7、Imp-A、Imp-C、Imp-F的对照品各适量，加甲醇制成约10 μg·mL-1的混合溶液，按“2.1”项的色谱条件连续进样7次，记录色谱图，以峰面积计算精密度。结果SYL927、927-1、927-2、927-3、927-5、927-6、927-7、Imp-A、Imp-C、Imp-F的精密度（RSD）分别为0.41%、0.43%、0.40%、0.76%、0.48%、0.39%、0.41%、0.33%、0.34%和0.31%，均小于1.0%，表明精密度良好。
2.9 溶液稳定性试验取“2.2”项下供试品溶液及“2.3”项下对照溶液，按“2.1”项色谱条件于0、2.5、5、10、15、20和25 h进样测定，记录色谱图，SYL927及各杂质峰面积的RSD均小于1.0%，表明供试品溶液和对照溶液室温放置25 h稳定。
2.10 准确度试验称取SYL927原料药样品7份（每份10 mg），分别置于10 mL量瓶中，分别加入含各杂质20 μg·mL-1的混合对照品溶液5 mL，用甲醇溶解并稀释至刻度，测定有关物质的量，计算回收率。9个有关物质927-1、927-2、927-3、927-5、927-6、927-7及Imp-A、Imp-C、Imp-F的回收率平均值分别为100.7%、101.1%、100.4%、101.3%、100.8%、100.4%、100.2%、101.1%和101.4%，RSD分别为0.98%、0.93%、1.2%、0.95%、0.96%、0.98%、2.2%、0.84%和1.1%，表明回收率良好。
2.11 耐用性试验在Agilent HC-C8（4.6 mm×250 mm，5 μm）、CAPVELL PAK C8（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Xtimata C8（4.6 mm×250 mm，5 μm）3款色谱柱上进行有关物质分离的考察；结果显示各色谱峰之间能够实现良好分离，分离度均大于1.5。同时也考察了不同柱流速（0.9 mL·min-1和1.1 mL·min-1）、不同流动相比例（乙腈-0.2%醋酸钠缓冲液起始比例19:81和乙腈-0.2%醋酸钠缓冲液起始比例21:79）、不同色谱柱温度（36 ℃和44 ℃）和不同的0.2%醋酸钠缓冲液pH（pH 3.5和pH 3.7）条件下的耐用性，结果表明，有关物质的分离度均可达到基线分离，分离度均大于1.5，方法耐用性较好。
2.12 有关物质的测定结果分别取供试品溶液及对照溶液各20 μL，注入液相色谱仪中，记录色谱图；如有杂质峰，按主成分自身对照法计算。3批原料药样品测定结果见表 4。
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表 4 原料药有关物质测定结果（%） Table 4 The determination results of related substance in SYL927 drug substance |
对流动相各组分以及各组分之间比例的摸索和优化，考察了SYL927与中间体、副产物和破坏产生的降解杂质等有关物质的峰形、保留时间和分离度，确定以乙腈-0.2%醋酸钠缓冲液（pH 3.6）为流动相梯度洗脱，可以使SYL927及各有关物质色谱峰之间均达到完全分离，且峰形良好。
3.2 检测波长的选择SYL927和4个中间体（927-1、927-2、927-6、927-7）和3个副产物（Imp-A、Imp-C、Imp-F）均在281~289 nm有最大吸收；而中间体927-5在295 nm有最大吸收，在283 nm有较大吸收；中间体927-3在254 nm有最大吸收，在283 nm也有吸收。破坏性试验产生的杂质在283 nm均有较大吸收，具有足够的检测灵敏度。因此选择283 nm作为有关物质检测波长。
3.3 有关物质测定方法的选择多批SYL927原料药的研究表明，中间体927-1、927-2、927-3、927-5、927-6在合成工艺中可被除去，SYL927原料药只检出副产物Imp-A、Imp-C、Imp-F和合成前体927-7。杂质的响应因子分别为Imp-A为0.9，Imp-C为1.0，927-7为0.9，Imp-F为1.1，均在0.9~1.1之间，与主成分响应相当，因此SYL927原料药采用主成分自身对照法对SYL927有关物质进行测定。
4 结论本试验建立了高效液相色谱检测SYL927原料药有关物质的方法，并进行了方法学研究，方法灵敏度高，专属性强。对多批原料药的检测及工艺研究，表明该方法可有效地分离和检测SYL927原料药中潜在的有关物质。SYL927破坏性试验结果表明，在氧化条件下，易产生降解，生成4个杂质，提示SYL927在生产、运输、贮存时应避免接触氧化剂，保证药品质量稳定。
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