超高效液相色谱-质谱检测羊奶中八大类74种禁限用药物方法研究

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刘洪斌, 蔡英华, 张鹭, 姜艳彬, 于雷, 李颖. 超高效液相色谱-质谱检测羊奶中八大类74种禁限用药物方法研究[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(6): 1036-1048. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.06.17.

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LIU Hong-bin, CAI Ying-hua, ZHANG Lu, JIANG Yan-bin, YU Lei, LI Ying. Simultaneous detection of eight categories of seventy four kinds of forbidden and restricted drug residues in goat milk using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2018, 38(6): 1036-1048. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.06.17.

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基金项目

十二五国家科技支撑计划项目（项目编号：2014BAD13B05）；兽药残留检测标准物质研制（项目编号：2013FY113300-1）

第一作者

刘洪斌, Tel:13426421377;E-mail:liuhongbin111@163.com。

通信作者

李颖, Tel:13552292554;E-mail:liying@163.com

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收稿日期：2017-05-25

Contents Abstract Full text Figures/Tables PDF

超高效液相色谱-质谱检测羊奶中八大类74种禁限用药物方法研究

刘洪斌 , 蔡英华 , 张鹭 , 姜艳彬 , 于雷 , 李颖

中国动物疫病预防控制中心, 北京 102609

收稿日期：2017-05-25

基金项目：十二五国家科技支撑计划项目（项目编号：2014BAD13B05）；兽药残留检测标准物质研制（项目编号：2013FY113300-1）

第一作者：刘洪斌, Tel:13426421377;E-mail:liuhongbin111@163.com

通信作者：李颖, Tel:13552292554;E-mail:liying@163.com

摘要：目的：为有效防范羊奶中药物残留风险，采用超高效液相色谱-质谱法建立羊奶中β-受体激动剂、磺胺、喹喏酮、大环内酯、苯并咪唑、镇静剂、抗病毒和截短侧耳素类共八大类74种禁限用药物残留检测方法。方法：样品经过0.5%甲酸乙腈溶液提取，Oasis PRiME HLB柱净化后，经Acquity UPLC BEH C₁₈柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，以甲醇和0.1%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，正离子多通道MRM信号采集模式，8大类药74种禁限用药物在10.5 min内分离完好。结果：在1.0~40.0 μg·L^-1浓度范围内，各类药物线性良好，相关系数均在0.991以上；羊奶中各类药物定量下限均低于0.5 μg·kg^-1，通过0.5、5.0、10.0 μg·kg^-1 3个浓度的添加回收试验表明，回收率在61.9%~119.7%，批内RSD为1.1%~17.6%，批间RSD为2.1%~18.5%。结论：方法的准确度及精密度满足GB/T 27404-2008技术要求。该方法弥补了现有国标方法同时检测药物种类少的缺点，对更全面筛查和确证羊奶中禁限用药物残留，监管羊奶质量安全具有一定的参考价值。

关键词：β-受体激动剂磺胺喹喏酮大环内酯苯并咪唑镇静剂抗病毒和截短侧耳素羊奶禁限用药物残留风险超高效液相色谱-质谱

Simultaneous detection of eight categories of seventy four kinds of forbidden and restricted drug residues in goat milk using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LIU Hong-bin, CAI Ying-hua, ZHANG Lu, JIANG Yan-bin, YU Lei, LI Ying

China Animal Disease Control Center, Beijing 102609, China

Abstract: Objective: To effectively prevent the risk of drug residues in goat milk, and develope a multiresidue method based on ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of eight categories of seventy four kinds of forbidden and restricted drug residues(β-agonists, sulfonamides, quinolones, macrolides, benzimidazoles, sedatives, antiviral drugs).Methods: Analytes were extracted by acidified acetonitrile, and purified by Oasis PRiME HLB SPE column.Seventy four forbidden and restricted drugs were analyzed by Acquity UPLC BEH C₁₈ column(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)using methanol and 0.1% formic acid as the mobile phases.The signals were acquired through the multi-channel MRM mode and positive ion mode.All analytes could be well-separated by a gradient program during 10.5 minutes.Results: The calibration curves of seventy four forbidden and restricted drugs were linear in a concentration range of 1.0-40.0 μg·L^-1(r>0.991), and the limits of quantitation were all less than 1.0 μg·kg^-1 in goat milk.The recoveries of 1.0, 10.0, 20.0 μg·kg^-1 fortified samples ranged from 61.9% to 119.7%, with the intra-assay coefficient of variation of 1.1%-17.6% and the inter-assay coefficient of variation of 2.1%-18.5%.Conclusion: Compared with the existing national standard, the proposed method has the advantage of detecting the quantity of forbidden and restricted drugs in goat milk.In order to monitor the quality of goat, the proposed method has a certain reference value for more comprehensive screening and confirmation of forbidden and restricted drugs in goat milk.

Key words: β-agonists sulfonamides quinolones macrolides benzimidazoles sedatives antiviral drugs goat milk forbidden and restricted drugs residues risk UPLC-MS/MS

羊奶相比于牛奶，具有脂肪粒和蛋白微粒小，矿物质和维生素丰富，更容易被人体吸收的特点；且羊奶从基础结构到营养配比更接近于人奶，尤其适合婴幼儿食用^[1]，同时羊奶中α_S-酪蛋白等异体蛋白含量较少，能大大降低过敏反应的发生^[2]。随着物质水平的提高，营养价值更高的羊奶及奶制品受到越来越多的追捧，但随着养殖行业规模化发展，为治疗预防动物疾病，往往采用多种类药物同时使用或滥用的现象，甚者有的不法分子为达到非法获利的目的，添加违禁药物，导致羊奶及组织中禁限用药物残留问题频出^[3]，对婴幼儿及体弱人群身体健康造成潜在威胁。

为了预防和治疗动物疾病，保证动物生长，畜禽养殖行业常用兽药主要有磺胺类、喹喏酮类、大环内酯类、苯并咪唑类、镇静剂类、抗病毒和截短侧耳素类等药物，由于科学养殖知识的缺乏和经济利益的趋势，超剂量使用现象尤为突出，其次不法兽药生产企业为追求疗效，多种类兽药复方使用，加之不合理的休药期限，导致动物体内同时残留多种兽药；同时为促进动物生长，铤而走险添加违禁药物以谋取私利的现象也时有发生。但目前大多检测方法^[4-7]和标准^[8-10]主要检测单一种类药物，多种类多残留同时检测的方法也存在检测药物数量和种类少的缺点^[11-14]，八大类74种兽药同时检测的液相色谱-串联质谱方法还少有报道，因此为满足对奶及奶制品质量安全监管，建立更多种类、更多数量兽药同时检测的确证方法尤为迫切。

1 材料与仪器 1.1 试剂与耗材

β-受体激动剂、磺胺、喹喏酮、大环内酯、苯并咪唑、镇静剂、抗病毒和截短侧耳素类共八类74种兽药对照品（具体药物见表 1）购于德国Dr. Ehrenstorfer公司和百灵威公司，纯度均在97%以上；甲醇、乙腈、甲酸等有机溶剂均为色谱纯，购自美国Fisher公司；Waters Oasis PRiME HLB SPE柱（60 mg，3 mL，填料：N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物）购于美国Waters公司。

表 1 v八大类74种禁限用药物的定性/定量离子对及其对应质谱参数及保留时间 Table 1 Qualitative ions, quantitative ions and relevant parameters of eight categories of seventy four kinds of forbidden and restricted drugs

药物（drugs）	母离子（precursor ion）m/z	子离子（daughter ion）m/z	驻留时间（dwell time）/ms	聚焦电压（focus voltage）/V	碰撞电压（collision voltage）/eV	保留时间（retention time）/min
奥西那林	212.1	124.9	0.05	23	23	2.35
（orciprenaline）		152.0	0.05		18
西马特罗	220.1	159.9	0.01	20	16	2.65
（cimaterol）		202.1	0.01		10
特布他林	226.1	124.9	0.01	25	25	2.77
（terbutaline）		151.9	0.01		16
沙丁胺醇	240.1	147.9	0.01	22	18	2.81
（salbutamol）		222.1	0.01		10
齐帕特罗	262.2	185.0	0.01	25	25	2.79
（zilpaterol）		244.2	0.01		13
西布特罗	234.2	159.9	0.01	25	15	3.05
（cimbuterol）		216.1	0.01		10
吡布特罗	241.1	121.8	0.01	30	28	2.62
（pyrbuterol）		148.9	0.01		25
羟苄羟麻黄碱	288.1	120.9	0.007	28	22	3.36
（ritodrine）		270.2	0.007		14
丙卡特罗	291.3	231.2	0.007	25	20	3.17
（procaterol）		273.2	0.007		15
非诺特罗	304.2	106.8	0.007	30	30	3.21
（fenoterol）		134.8	0.007		18
瑞普特罗	390.3	221.1	0.007	30	25	3.13
（reproterol）		372.2	0.007		18
羟甲基克仑特罗	293.0	202.9	0.005	25	18	4.16
（hydroxymethylclenbuterol）		275.0	0.005		12
克仑塞罗	319.1	203.1	0.005	30	20	3.75
（clencyclohexerol）		301.2	0.005		15
克仑普罗	263.1	202.9	0.005	20	18	4.26
（clenproperol）		245.1	0.005		12
氯丙那林	213.9	153.8	0.005	25	16	4.89
（clorprenaline）		196.0	0.005		12
克仑特罗	277.1	202.9	0.005	25	16	4.98
（clenbuterol）		259.1	0.005		10
莱克多巴胺	302.2	106.8	0.005	25	28	4.75
（ractopamine）		163.9	0.005		16
妥布特罗	228.1	153.8	0.005	25	16	5.32
（tulobuterol）		171.8	0.005		12
美托洛尔	268.2	115.9	0.005	35	20	5.15
（metoprolol）		191.0	0.005		18
马布特罗	311.1	237.1	0.005	25	18	5.38
（mabuterol）		293.2	0.005		12
马喷特罗	325.1	217.1	0.005	28	20	5.60
（mapenterol）		237.0	0.005		15
福莫特罗	345.2	120.9	0.005	28	20	5.13
（formoterol）		148.9	0.005		20
溴布特罗	367.0	212.0	0.005	30	30	5.34
（brombuterol）		293.1	0.005		20
班布特罗	368.4	71.9	0.005	35	35	5.44
（bambuterol）		294.2	0.005		20
奥达特罗	387.2	163.0	0.005	30	20	5.46
（olodaterol）		207.1	0.005		20
喷布特罗	292.3	201.1	0.005	29	20	6.17
（penbutolol）		236.1	0.005		17
苯乙醇胺A	345.2	149.9	0.005	20	25	5.72
（phenyl EA A）		327.2	0.005		15
磺胺嘧啶	251.0	107.8	0.01	28	22	2.98
（sulfadiazine）		155.8	0.01		16
磺胺塞唑	255.9	91.8	0.01	25	21	3.16
（sulfathiazole）		155.8	0.01		15
磺胺醋酰	215.0	107.8	0.01	18	18	2.71
（sulfacetamide）		155.8	0.01		10
磺胺吡啶	250.0	155.9	0.005	25	16	3.26
（sulfapyridine）		183.9	0.005		19
磺胺甲嘧啶	265.0	155.8	0.005	28	18	3.41
（sulfamerazine）		171.8	0.005		16
磺胺异唑	268.0	107.8	0.005	23	22	3.83
（sulfisoxazole）		155.8	0.005		20
磺胺二甲唑	268.0	112.8	0.005	25	15	3.83
（sulfamoxol）		155.8	0.005		16
磺胺二甲嘧啶	279.1	123.9	0.005	30	20	3.97
（sulfamethazine）		185.9	0.005		18
磺胺甲氧哒嗪	281.0	107.8	0.005	30	25	4.33
（sulfamethoxypyridazine）		155.8	0.005		18
磺胺多辛	311.1	107.8	0.005	30	30	4.98
（sulfadoxine）		155.9	0.005		20
磺胺苯酰	277.1	107.8	0.005	22	22	5.29
（sulfabenzamide）		155.8	0.005		10
磺胺喹喔啉	301.1	107.8	0.005	30	23	5.65
（sulfaquinoxaline）		155.8	0.005		18
磺胺甲唑	254.0	91.8	0.005	28	25	4.86
（sulfamethoxazole）		155.8	0.005		15
磺胺地索辛	311.1	107.8	0.005	30	28	4.98
（sulfadimethoxine）		155.8	0.005		20
磺胺间甲氧嘧啶	281.1	108	0.005	30	25	4.93
（sulfamonomethoxine）		155.9	0.005		16
吡哌酸	304.0	189	0.005	30	30	3.53
（pipemidic acid）		217.1	0.005		20
氧氟沙星	362.1	261.1	0.005	30	25	4.15
（ofloxacin）		318.1	0.005		20
加替沙星	376.4	261.2	0.005	35	30	5.09
（gatifloxacin）		358.3	0.005		20
沙拉沙星	386.2	299.1	0.005	30	27	4.97
（sarafloxacin）		342.2	0.005		19
奥比沙星	396.4	295.2	0.005	28	22	4.87
（orbifloxacin）		352.3	0.005		18
曲伐沙星	417.3	330.2	0.005	25	35	5.55
（trovafloxacin）		399.4	0.005		20
加雷沙星	427.4	286.2	0.005	30	30	5.55
（garenoxacin）		366.3	0.005		20
诺氟沙星	320.0	276.2	0.005	30	15	4.48
（norfloxacin）		302.2	0.005		20
环丙沙星	332.1	288.1	0.005	30	18	4.70
（ciprofloxacin）		314.1	0.005		23
培氟沙星	334.2	290.2	0.005	35	15	4.18
（pefloxacin）		316.2	0.005		20
洛美沙星	352.1	265.1	0.005	30	23	4.84
（lomefloxacin）		308.1	0.005		15
达氟沙星	358.2	283.1	0.005	30	21	4.79
（danofloxacin）		340.1	0.005		20
恩诺沙星	360.2	245.1	0.005	30	25	4.75
（enrofloxacin）		316.2	0.005		18
吉米沙星	390.4	313.3	0.005	30	28	5.51
（gemifloxacin）		372.3	0.005		20
莫西沙星	402.4	261.1	0.005	30	23	5.37
（moxifloxacin）		384.4	0.005		25
司帕沙星	393.1	292.2	0.005	35	25	5.27
（sparfloxacinspara）		349.2	0.005		20
二氟沙星	400.2	356.1	0.005	30	20	4.88
（difloxacin）		382.1	0.005		25
那氟沙星	361.3	283.4	0.005	25	35	6.10
（nadifloxacin）		343.2	0.005		22
萘啶酸	233.0	187	0.005	20	25	5.95
（nalidixic acid）		215	0.005		15
氟甲喹	262.2	202	0.005	25	30	6.03
（flumequine）		244.1	0.005		20
噻苯咪唑	202.0	130.9	0.005	35	30	4.14
（thiabendazole）		174.9	0.005		23
阿苯达唑砜	298.2	158.9	0.005	28	36	5.58
（albendazolesulfone）		224	0.005		25
奥芬达唑	316.1	158.9	0.005	35	35	5.77
（oxfendazole）		191	0.005		22
克林霉素	425.2	125.8	0.005	30	28	5.76
（clindamycin）		377.3	0.005		16
罗红霉素	837.7	158	0.005	35	35	6.17
（roxithromycin）		679.6	0.005		20
替米考星	870.0	155.9	0.005	65	45	5.60
（tilmicosin）		174	0.005		45
泰妙菌素	494.4	118.8	0.005	35	40	5.91
（taimulin）		192	0.005		20
沃尼妙林	565.5	163.9	0.005	28	30	6.19
（valnemulin）		263.2	0.005		20
金刚烷胺	151.9	92.8	0.005	30	30	4.95
（amantadine）		134.9	0.005		18
金刚乙胺	180	80.8	0.005	28	23	5.79
（rimantadine）		162.9	0.005		18
氯丙嗪	319.2	57.9	0.005	30	30	6.16
（chlorpromazine）		85.9	0.005		20
氮哌酮	328.3	122.8	0.005	40	35	4.68
（azaperone）		164.9	0.005		20

将上述对照品用甲醇配制成单标母液，并配制10 μg·mL^-1混合储备液于-20 ℃保存，系列标准工作液现用现配；羊奶样品购于电商超市，选择经LC-MS/MS分析确认为阴性羊奶样本作为基质添加样本。

1.2 仪器设备

超高效液相色谱仪（H-Class UPLC）串接三重四极杆质谱仪（xevo TO-XS），美国Waters公司；3K15型离心机，美国Sigma公司；纯水仪，美国Millipore公司。氮吹仪，美国Organomation公司。

2 方法 2.1 前处理过程

提取：准确称取2 g（精确到0.01 g）羊奶于50 mL离心管中，加入0.5%甲酸乙腈溶液10 mL，9 500 r·min^-1离心5 min，取上清液于一50 mL离心管中，重复提取1次，合并提取液，待过净化柱。

净化：将全部提取液转移至事先用85%乙腈溶液活化的Oasis PRiME HLB柱中，保持流速1~2滴·s^-1，收集全部滤过液，50 ℃氮气吹至近干，用初始流动相定容至1 mL，12 000 r·min^-1离心5 min，上液层使用0.22 μm滤膜过滤，待上机测定。

2.2 液相色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C₁₈柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，填料为十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒，Waters公司）；流动相：甲醇（A），0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0~0.5 min，3%A保持不变；0.5~2.0 min，3%A线性变化至25%；2.0~3.5 min，25%A保持不变；3.5~3.6 min，25%A线性变化至40%；3.6~4.0 min，40%A保持不变；4.0~5.5 min，40%A线性变化至90%；5.5~8.0 min，90%A保持不变；8.0~8.1 min，90%A线性变化至3%；8.1~10.5 min，3%A保持不变）；流速：0.3 ml·min^-1。

2.3 质谱条件

电离模式：ESI+；毛细管电压：3.0 kV；萃取锥孔电压：3 V；RF透镜电压：0.5 V；源温：150 ℃；脱溶剂温度：600 ℃；锥孔气流速：50 L·h^-1；脱溶剂气流速：900 L·h^-1；碰撞气流速：0.14 mL·min^-1；采集模式：多通道多时段MRM采集；八大类74种药物优化质谱参数及保留时间见表 1。

3 结果与分析 3.1 质谱条件优化

β-受体激动剂、磺胺、喹喏酮、大环内酯、苯并咪唑、镇静剂、抗病毒和截短侧耳素类共8类药物结构中均含有氨基结构，因此选用正离子模式采集数据，MS Scan模式下进行一级质谱分析，得到[M+H]⁺峰，并优化各自聚焦电压使其准分子离子峰响应最佳，然后在Daughter Scan模式下针对各自[M+H]⁺峰进行二级质谱扫描，获得丰富的碎片离子信息。通过文献^[8]对比实验发现，各类化合物碎片离子和丢失离子存在一定共性，其中β-受体激动剂类羟甲基克仑特罗、克仑塞罗、克仑普罗和克仑特罗具有相同的碎片离子m/z 202.9，推测是各自准分子离子峰[M+H]⁺，脱去H₂O分子后，经结构重排失去（2-甲基丙烯）得到的特征碎片；而沙丁胺醇、西布特罗、丙卡特罗、瑞普特罗、克仑普罗等丢失离子普遍为m/z 60.2、m/z 18.0、m/z 74.3分别为脱H₂O+丙烯峰、脱H₂O峰和脱H₂O+2-甲基丙烯峰；喹诺酮类药物主要碎裂机理为喹诺酮化合物准分子离子峰[M+H]⁺的脱水峰（[M+H-H₂O]⁺）、脱羧峰（[M+H-CO₂]⁺）以及脱羧后哌嗪环断裂发生结构重排失去CHR的产物离子（[M+H-CO₂-CHR]⁺），如曲伐沙星m/z 399.4、莫西沙星m/z 384.4为（[M+H-H₂O]+），曲伐沙星m/z 330.2、加替沙星m/z 261.2峰为（[M+H-CO₂-CHR]+）造成。实验选择各自准分子离子和2对强度较高的子离子以满足欧盟2002/957/EC决议中关于质谱分析法定性定量不少于4分的要求，并优化碰撞电压使其响应强度最佳。

受仪器条件所限，单一通道无法一次性进行全部74种药物的同时扫描，因此实验采用多通道模式，同时因为药物种类较多，出峰时间较为集中在2~6 min内的现象，实验对不同通道进行时间分段，保证每一种药物具有充足的扫描频率，实验还对每种药物驻留时间在0.005~0.05 ms之间进行优化，保证各色谱峰上都能达到10~12个数据采集点，确保每种药物都能得到较高的灵敏度和准确定量。

3.2 提取条件优化

由于β-受体激动剂、磺胺、喹喏酮、大环内酯、苯并咪唑、镇静剂、抗病毒和截短侧耳素类共八大类药物极性及化学性质差别较大，同时提取时对提取条件要求较高，前处理专一性越强，处理方法环节越多，多种类同时提取的适应性越差，损失越严重，为了兼顾各种药物的提取回收率并结合文献方法^[15-17]，采用酸化有机相作为提取剂，通过空白羊奶样品添加10.0 μg·kg^-1八大类混合标准溶液，比较0.2%、0.5%、1.0%、2.0%甲酸乙腈溶液为提取溶剂处理样品，经UPLC-MS/MS检测发现：酸性有机试剂提取条件下，大多数药物回收率出现先增大后减小的趋势（以β-受体激动剂为例见图 1），原因推测为随着加入甲酸量的加大，药物的离子化程度增大，其在高比例有机相中溶解性逐渐减弱，其中磺胺类药物回收率降低尤为明显（见图 2），综合各类药物回收率发现0.5%甲酸乙腈溶液提取效果较好，74种药物回收率均能达到60%以上。

图 1 不同提取溶剂下β-受体激动剂类药物提取回收率 Figure 1 Recoveries of β-agonists were obtained by different extraction conditions

图 2 不同提取溶剂下磺胺类药物提取回收率 Figure 2 Recoveries of sulfonamides were obtained by different extraction conditions

3.3 基质效应

动物源性基质采用质谱进行定量分析时会存在不同程度和来源的基质效应^[18-19]，为评估基质效应的影响，一般会设计基质效应对照实验。本实验采取提取后添加法^[20]，通过测定基质效应系数（ME）来判断基质效应影响大小，若ME小于1.0，说明基质对待测物的响应产生抑制作用；若大于1.0，说明基质的存在增强效果。实验结果发现八大类药物在羊奶基质中均有不同程度的基质效应存在，其中β-受体激动剂ME在0.56~1.08之间，磺胺ME在0.39~0.93之间，喹喏酮ME在0.57~1.06之间，大环内酯、苯并咪唑、镇静剂、抗病毒和截短侧耳素类ME在0.32~1.06之间，因此在检测过程中应采用基质加标溶液，消除基质效应的影响，不同药物基质抑制程度见图 3。

图 3 基质效应图 Figure 3 The figure of matrix effect in goat milk

3.4 线性方程及灵敏度试验

实验采用空白羊奶样品经“2.1”项方法处理，在1.0~80.0 μg·L^-1浓度范围内分别添加药物混标溶液，配制1.0、5.0、10.0、40.0、80.0 μg·L^-1基质加标溶液，依次进样，以色谱峰面积为纵坐标，化合物质量浓度为横坐标做标准曲线，实验结果表明所有药物1.0~40.0 μg·L^-1范围内线性良好，相关系数均大于0.991，结果见表 2。

表 2 羊奶中八大类74种药物线性范围、相关系数及定量限值 Table 2 Linear ranges, linear coefficients and the limits of quantitation of eight categories of seventy four kinds of forbidden and restricted drugs in goat milk

药物（drug）	线性范围（linear range）/ （μg·L^-1）	线性方程（linear equation）	相关系数（linear coefficient）R²	定量限（limit of quantitation）/ （μg·kg^-1）
奥西那林（orciprenaline）	1.0~40.0	Y=563.8X-112.5	0.995	0.2
西马特罗（cimaterol）	1.0~40.0	Y=695.0X+341.2	0.999	0.2
特布他林（terbutaline）	1.0~40.0	Y=881.0X-154.0	0.997	0.1
沙丁胺醇（salbutamol）	1.0~40.0	Y=660.4X-357.4	0.996	0.2
齐帕特罗（zilpaterol）	1.0~40.0	Y=327.2X+356.6	0.996	0.2
西布特罗（cimbuterol）	1.0~40.0	Y=279.9X-107.5	0.993	0.3
吡布特罗（pyrbuterol）	1.0~40.0	Y=561.1X-240.12	0.992	0.2
丙卡特罗（procaterol）	1.0~40.0	Y=192.8X-158.85	0.995	0.2
瑞普特罗（reproterol）	1.0~40.0	Y=197.6X+48.88	0.998	0.2
非诺特罗（fenoterol）	1.0~40.0	Y=195.8X-177.83	0.994	0.4
羟苄羟麻黄碱（ritodrine）	1.0~40.0	Y=282.8X-179.3	0.997	0.4
羟甲基克仑特罗（hydroxymethylclenbuterol）	1.0~40.0	Y=588.0X-100.6	0.992	0.2
克仑普罗（clenproperol）	1.0~40.0	Y=794.4X+319.6	0.999	0.1
克仑塞罗（clencyclohexerol）	1.0~40.0	Y=176.0X-149.1	0.993	0.4
氯丙那林（clorprenaline）	1.0~40.0	Y=921.4X-69.20	0.995	0.1
克仑特罗（clenbuterol）	1.0~40.0	Y=803.2X-241.6	0.996	0.1
妥布特罗（tulobuterol）	1.0~40.0	Y=1 324X-943.5	0.992	0.2
莱克多巴胺（ractopamine）	1.0~40.0	Y=495.0X-341.0	0.994	0.2
马布特罗（mabuterol）	1.0~40.0	Y=1 315X-892.0	0.995	0.2
美托洛尔（metoprolol）	1.0~40.0	Y=214.0X-338.35	0.997	0.2
马喷特罗（mapenterol）	1.0~40.0	Y=1 551X-665.794	0.994	0.2
溴布特罗（brombuterol）	1.0~40.0	Y=404.3X+255.3	0.999	0.3
福莫特罗（formoterol）	1.0~40.0	Y=1 302X-599.8	0.998	0.2
班布特罗（bambuterol）	1.0~40.0	Y=1 030X-225.2	0.996	0.2
奥达特罗（olodaterol）	1.0~40.0	Y=417.3X+93.70	0.994	0.3
喷布特罗（penbutolol）	1.0~40.0	Y=1 124X-157.12	0.995	0.2
苯乙醇胺A（phenyl EA A）	1.0~40.0	Y=724.4X+174.8	0.992	0.2
磺胺醋酰（sulfacetamide）	1.0~40.0	Y=164.0X-183.7	0.997	0.5
磺胺二甲唑（sulfamoxol）	1.0~40.0	Y=212.5X-76.52	0.991	0.3
磺胺嘧啶（sulfadiazine）	1.0~40.0	Y=422.7X-257.6	0.994	0.1
磺胺塞唑（sulfathiazole）	1.0~40.0	Y=101.8X-22.07	0.999	0.4
磺胺吡啶（sulfapyridine）	1.0~40.0	Y=80.15X-5.999	0.996	0.5
磺胺甲嘧啶（sulfamerazine）	1.0~40.0	Y=106.1X-117.2	0.995	0.3
磺胺异唑（sulfisoxazole）	1.0~40.0	Y=120.8X-102.2	0.997	0.4
磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine）	1.0~40.0	Y=303.6X-142.2	0.993	0.4
磺胺甲氧哒嗪（sulfamethoxypyridazine）	1.0~40.0	Y=493.0X-346.2	0.998	0.3
磺胺多辛（sulfadoxine）	1.0~40.0	Y=540.3X-62.17	0.992	0.2
磺胺苯酰（sulfabenzamide）	1.0~40.0	Y=256.5X-179.0	0.996	0.4
磺胺甲唑（sulfamethoxazole）	1.0~40.0	Y=155.5X-92.52	0.995	0.4
磺胺地索辛（sulfadimethoxine）	1.0~40.0	Y=669.0X-258.4	0.991	0.3
磺胺间甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine）	1.0~40.0	Y=211.5X-202.73	0.999	0.3
磺胺喹喔啉（sulfaquinoxaline）	1.0~40.0	Y=1 130X+86.59	0.994	0.3
吡哌酸（pipemidic acid）	1.0~40.0	Y=183.2X-179.2	0.995	0.5
氧氟沙星（ofloxacin）	1.0~40.0	Y=230.9X-82.87	0.993	0.4
加替沙星（gatifloxacin）	1.0~40.0	Y=84.92X-89.38	0.997	0.3
沙拉沙星（sarafloxacin）	1.0~40.0	Y=489.75X+76.73	0.994	0.4
奥比沙星（orbifloxacin）	1.0~40.0	Y=160.1X-87.06	0.992	0.5
曲伐沙星（trovafloxacin）	1.0~40.0	Y=383.934X-377.2	0.991	0.3
加雷沙星（garenoxacin）	1.0~40.0	Y=97.68X-76.78	0.999	0.5
诺氟沙星（norfloxacin）	1.0~40.0	Y=300.0X+963.9	0.995	0.5
环丙沙星（ciprofloxacin）	1.0~40.0	Y=146.8X+377.2	0.997	0.4
培氟沙星（pefloxacin）	1.0~40.0	Y=261.7X-0.438 4	0.992	0.5
洛美沙星（lomefloxacin）	1.0~40.0	Y=300.43X-272.1	0.992	0.4
达氟沙星（danofloxacin）	1.0~40.0	Y=1 180X-160.7	0.995	0.3
恩诺沙星（enrofloxacin）	1.0~40.0	Y=301.4X-58.10	0.997	0.5
吉米沙星（gemifloxacin）	1.0~40.0	Y=64.42X+2.682	0.991	0.4
莫西沙星（moxifloxacin）	1.0~40.0	Y=288.4X-301.6	0.992	0.4
司帕沙星（sparfloxacinspara）	1.0~40.0	Y=281.5X-268.5	0.993	0.5
二氟沙星（difloxacin）	1.0~40.0	Y=296.9X-182.4	0.997	0.5
那氟沙星（nadifloxacin）	1.0~40.0	Y=1 202X-960.7	0.994	0.2
萘啶酸（nalidixic acid）	1.0~40.0	Y=1 764X-1 157	0.998	0.2
氟甲喹（flumequine）	1.0~40.0	Y=636.2X-504.562	0.999	0.4
金刚烷胺（amantadine）	1.0~80.0	Y=2 800X-522.2	0.995	0.1
金刚乙胺（rimantadine）	1.0~80.0	Y=1 964X-1 157	0.998	0.2
噻苯咪唑（thiabendazole）	1.0~80.0	Y=1 157X-664.0	0.996	0.2
阿苯达唑砜（albendazolesulfone）	1.0~80.0	Y=841.3X-870.5	0.992	0.4
奥芬达唑（oxfendazole）	1.0~80.0	Y=956.6X-450.6	0.993	0.2
克林霉素（clindamycin）	1.0~80.0	Y=1 565X-1 098	0.995	0.4
罗红霉素（roxithromycin）	1.0~80.0	Y=1 057X-680.8	0.998	0.5
替米考星（tilmicosin）	1.0~80.0	Y=70.64X-96.12	0.996	0.1
沃尼妙林（valnemulin）	1.0~80.0	Y=671.8X+39.15	0.992	0.3
泰妙菌素（taimulin）	1.0~80.0	Y=2 278X-1 942	0.993	0.2
氯丙嗪（chlorpromazine）	1.0~80.0	Y=1 381X-1 066	0.992	0.1
氮哌酮（azaperone）	1.0~80.0	Y=757.3X-633.6	0.997	0.2

将处理好的空白羊奶样品逐级添加标准溶液，按10倍信噪比确定方法的定量下限（LOQ），结果表明74种药物定量下限均小于0.5 μg·kg^-1，具体见表 2。

3.5 回收率和精密度试验

取空白羊奶样品，添加浓度为0.5、5.0、10.0 μg·kg^-1 3个水平混标溶液，批内6次平行，不同时间重复测定3个批次，进行添加回收试验。平均回收率在61.9%~119.7%，批内RSD为1.1%~17.6%，批间RSD为2.1%~18.5%，方法的准确度及精密度满足GB/T 27404—2008技术要求。同时实验还发现当添加浓度增加到40.0 μg·kg^-1时，大部分药物的回收率会出现大幅减低，推测原因为八大类药物同时添加时，前处理方法规定的提取溶剂提取不完全，造成目标化合物损失；其次添加浓度超出对应药物的线性范围造成定量不准确。

3.6 实际样品检测

应用该方法对超市购买的10份羊奶样品和3份实验室盲样添加阳性羊奶样本进行测定，实验结果显示，购买的羊奶及奶粉样本中未检测到8大类药物残留，3份盲样阳性样本中，分别检出克仑特罗含量为6.3 μg·kg^-1、环丙沙星15.4 μg·kg^-1、金刚烷胺8.2 μg·kg^-1（阳性样本图谱见图 4），与原添加浓度（克仑特罗8.0 μg·kg^-1、环丙沙星20.0 μg·kg^-1、金刚烷胺10.0 μg·kg^-1）相比较，回收率分别为78.8%、77.0%和82.0%，符合国标中对回收率范围的要求，进一步表明该方法适用于羊奶中各类药物检测。

图 4 阳性样本色谱图 Figure 4 The chromatograms obtained from positive samples

4 结论

本实验通过对质谱条件和前处理过程进行优化，建立了同时检测羊奶八大类74种药物的超高效液相色谱-串联质谱方法，并对羊奶样本的基质效应的影响进行研究，并对所建方法进行了方法学验证和实际样本、盲样考核检测，验证该方法满足羊奶中多种类药物同时检测要求。该方法前处理简单高效，结果准确，适用于大批量样本中多种禁限用药物残留检测的需要，对应对动物源性产品中非法添加和保障畜产品安全具有参考作用。

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