胱氨酸片为氨基酸类药，其有效成分胱氨酸作为人体所必需的重要氨基酸之一，在生理学上起着十分重要的作用，主要用于病后和产后继发性脱发症、慢性肝炎的辅助治疗，临床上常用胱氨酸片配伍其他药物治疗斑秃^[1-3]。胱氨酸片的含量测定，中国药典2015年版二部采用滴定法^[4]，虽然可以满足胱氨酸的测定要求，但也存在不足，如滴定靠肉眼识别判断终点，存在个人偏差，而且其终点的颜色易受滴定温度、光照等环境因素影响，同时测定所需的2种滴定液配制标定复杂，滴定液浓度易变化，不稳定，不适合大批量检测样品。目前报道的胱氨酸片定量测定方法除药典经典方法外，主要还有比色法^[5]、单扫描极谱法^[6-7]、二次微分简易示波伏安法^[8]和分光光度法^[9-10]等，氨基酸分析仪法^[11-12]、紫外光谱法^[13]、荧光探针法^[14]、离子色谱安培法^[15]、高效液相色谱法及结合其他设备法^[16-19]等新型检测技术也逐步被运用于测定不同基质中的胱氨酸含量。应用氨基酸分析仪来测定胱氨酸片的含量，成本相对较低，专属性强，结果稳定性高，不易受其他因素的干扰。因此，本实验利用氨基酸分析仪，建立一种直接、快速测定胱氨酸片中胱氨酸含量的方法。

1 仪器与试药 1.1 仪器

S433-D氨基酸分析仪(德国赛卡姆(北京)科学仪器有限公司)，XS-205DU电子天平，梅特勒-托利多中国METTLER TOLEDO公司生产；SYNERGY-UV纯水机，法国Millipore公司生产；Ameritech AVP-7160隔膜真空泵，美瑞泰克(天津)科技有限公司生产；S470-B多参数测试仪，梅特勒-托利多中国METTLER TOLEDO公司生产；KQ-250DB型数控超声波清洗器(舒美牌台式)，昆山市超声仪器有限公司生产。

1.2 试药

胱氨酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：140624-201506，供鉴别和含量测定用，含量为99.8%)；胱氨酸片(山西云鹏制药有限公司/山西汾河制药有限公司，规格每片50 mg，批号A160102、A160401、150201、160201)；甲醇为色谱纯；乙二胺四乙酸、柠檬酸钠、氢氧化钠、苯酚、硼酸均为优级纯，购于天津市科密欧化学试剂有限公司；三水醋酸钠、醋酸、盐酸、醋酸钾均为优级纯，购于国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇为分析纯，购于广东光华科技股份有限公司；柠檬酸为优级纯，购于天津市光复科技有限公司；水合茚三酮为优级纯，购于上海三爱思；实验用水为超纯水。

2 方法与结果 2.1 样品稀释液的制备

取柠檬酸钠19.60 g于1 L的烧杯中，分别加无水乙醇20 mL，硼酸1.20 g，盐酸17.3 mL，水约800 mL，搅拌溶解，转移溶液至1 000 mL量瓶中，最后用水定容至刻度，摇匀，制得样品稀释液，待用。

2.2 对照品溶液的制备

精密称量胱氨酸对照品50.19 mg于100 mL量瓶中，加入稀盐酸溶液2 mL摇匀，再加样品稀释液适量，超声(250 W，100 kHz)5 min，放冷至室温后，用样品稀释液定容至刻度，摇匀，制得浓度为0.50 mg·mL^-1的对照品溶液，待用。

2.3 样品溶液的制备

取本品20片，精密称定，研匀，精密称量胱氨酸粉末约10 mg，置100 mL量瓶中，加入适量的样品稀释液，超声(250 W，100 kHz)15 min，放冷至室温后，再用样品稀释液定容至刻度，摇匀，过0.45 µm滤膜，即得。

2.4 色谱条件

采用Sykam Cation Separation Coiumn(LCA KO6/Na 4.6 mm×150 mm)分离柱，LCA KO4/Na (4.6 mm×100 mm)预柱，以洗脱泵0.45 mL·min^-1+衍生泵0.25 mL·min^-1为流速，分光光度检测器，进行梯度洗脱，柱温为57~74 ℃梯度控温，反应器温度为130 ℃，检测波长570 nm，进样量20 µL。流动相组成详见表 1，柱温程序详见表 2。

2.5 专属性考察

取“2.2”项下对照品溶液、“2.3”项下样品溶液，精密吸取20 µL，按上述色谱条件上机进行测定。结果见图 1，图上无明显杂质峰，表明其专属性强。

2.6 线性关系考察

取“2.2”项下对照品溶液0.10、0.20、0.50、1.00、1.50、2.00 mL，分别置10 mL量瓶中，然后用上述样品稀释液定容至刻度，配制成质量浓度为5.01、10.02、25.04、50.09、75.14、100.18 µg·mL^-1的溶液，精密吸取20 µL，在“2.4”项色谱条件下测定。以胱氨酸对照品峰面积的积分值为纵坐标，浓度为横坐标，作线性回归分析，得回归方程：

$ Y=141.45X-95.179 \ \ \ r=0.999 \ 9 $

胱氨酸的线性范围在5.01~100.18 µg·mL^-1之间。表明该方法有良好的线性关系。

2.7 精密度试验

取“2.6”项下质量浓度为75.14 µg·mL^-1的对照品溶液，连续进样6次，按上述“2.4”项下的色谱条件进行精密度测定。结果胱氨酸峰面积的RSD为0.10%(n=6)，表明该方法的仪器精密度令人满意。

2.8 重复性试验

取胱氨酸片(批号：A160102)供试品6份，按“2.3”项下方法制备胱氨酸供试品溶液，然后在“2.4”项色谱条件下测定。测得胱氨酸平均含量(标示量%)为97.38%，RSD为0.22 %(n=6)，表明该方法的重现性良好。

2.9 稳定性试验

取同一份供试品(批号：A160102)，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样20 µL，在“2.4”项下色谱条件测定。测得胱氨酸峰面积的RSD为0.19%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.10 回收率试验和检测下限

精密称取已知含量供试品片粉9份(批号A160102)，每3份一组，置于100 mL量瓶中，分别加入“2.2”项下对照品溶液3、4.5、6 mL，再加样品稀释液适量，超声(250 W，100 kHz)15 min，放冷至室温后，用样品稀释液定容至刻度，摇匀，过0.45 µm的微孔滤膜，即得低、中、高3种不同浓度的回收溶液。在“2.4”项色谱条件下测定，由回归方程算出该方法的回收率。结果胱氨酸3个加入量所对应的平均回收率分别为99.4%、100.1%、100.6%，RSD分别为1.0%、0.68%、0.69%，总平均回收率为100.0%(n=9)。以对照品溶液3.15的信噪比计算该方法的检出下限，结果为0.26 µg·mL^-1。

2.11 样品测定 2.11.1 滴定法

取胱氨酸片4批(批号A160102、A160401、150201、160201)，每批取供试品10份，按中国药典2015年版方法测定胱氨酸的含量(标示量%)，结果均符合中国药典规定且RSD均小于0.50%，见表 3。

2.11.2 本文方法

取胱氨酸片4批(批号A160102、A160401、150201、160201)，每批取供试品10份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件测定含量，通过回归方程计算胱氨酸的含量(标示量%)，结果均符合中国药典规定且RSD均小于0.50%，结果见表 3。

2.12 两法的测定结果比较

用SPSS统计软件对2种方法的测定结果进行统计分析，发现其t值均小于查表的t_0.05/2，18=2.101，故P＞0.05，差异无统计学意义。结果表明：同一批号的胱氨酸片采用不同方法测定胱氨酸的含量，2种测定结果无显著性差异。

3 讨论 3.1 样品处理方法

本法采用直接超声溶解法处理样品后，上机测定胱氨酸片中胱氨酸的含量，发现其峰形和重复性良好，精密度高，专属性强，且操作简便，引入误差机会少，干扰少，适合大批量检测样品。实验发现，中国药典采用滴定法对胱氨酸片中胱氨酸进行含量测定时，样品前处理步骤烦琐，耗时较长，检验效率偏低，易受其他因素干扰，容易造成误差，不适合大批量检测样品。

3.2 样品稀释液

胱氨酸不仅具有比较活泼的还原性质，而且也属于人体氨基酸中含硫的氨基酸，因此容易被氧化。本法使用柠檬酸三钠-盐酸-无水乙醇-苯酚作为样品稀释液，发现胱氨酸片在其中易溶，峰形较良好，无分差，无干扰，且稳定性好；添加适量的苯酚可以使其稳定保存，故选用此样品稀释液进行含量测定。但采用上述样品稀释液直接溶解其高浓度的对照品胱氨酸时，发现需要超声很久才能使其完全溶解。通过实验，发现胱氨酸易溶于稀酸，且加入稀酸后上机测定，发现其峰形和峰面积未受到影响，故在处理对照品胱氨酸时，先加入2 mL的稀盐酸溶液。

3.3 色谱条件

胱氨酸具有含硫基团，在空气中不稳定，对照品和供试品溶液需临用新制。采用本法处理后的对照品或供试品溶液均稳定，且可以使用氨基酸分析仪装机推荐的方法，无需修改色谱条件，便可进行测定，且胱氨酸的峰形良好，无拖尾峰，其余氨基酸对于胱氨酸出峰时间和位置无干扰，而且没有其他明显的干扰峰等。本实验不需要考察新的色谱条件，就可以直接上机测定，大大地提高了检验效率。梯度洗脱和梯度控温也可根据实际需要和具体样品进行调整，以缩短出峰时间，提高检验效率。

3.4 本法与滴定法比较

比较本法与中国药典滴定法^[4]的含量测定结果，本法结果稍偏高，可能是由于滴定法在硫代硫酸钠滴定过程中因溴的挥发，使得滴定结果偏低所致。但同一批号的胱氨酸片采用2种不同的方法来测定其胱氨酸的含量，结果无显著性差异。滴定法易受其他因素影响，如操作过程烦琐，需要肉眼判断滴定终点，容易出现操作误差，滴定终点的判断受温度、光照等环境影响；同时，采用对照品溶液来滴定，滴定液配制复杂，浓度易变化，不稳定，且易过期，不适合大批量检测样品。本法采用样品稀释液直接超声溶解样品，前处理简单，外界环境干扰少，溶液稳定；使用氨基酸分析仪可以准确、快速地测出胱氨酸片中胱氨酸的含量，并且该仪器的专属性强，灵敏度高，适用于大批量胱氨酸片中胱氨酸的含量测定。

4 结论

本实验使用氨基酸分析仪，建立一种测定胱氨酸片含量的方法，与中国药典的滴定法比较，分析速度、操作方法等方面有了大幅度提升，可以进行大批量样品检测，为使用氨基酸分析仪进行胱氨酸片的含量测定提供一种更快速、简便的新方法。