2018, Vol. 38 
林可霉素利多卡因凝胶由盐酸林可霉素、盐酸利多卡因和水性凝胶基质组成, 主要用于治疗外科烧伤及蚊虫叮咬引起的各种皮肤感染[1-2]。由于含抗感染药物的外用制剂具有较强的抑菌活性, 并且凝胶不易通过滤膜, 所以建立该类品种的微生物限度检查方法有一定的难度。
本文根据2015年版中国药典通则1105非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法和通则1106控制菌检查法的要求, 对林可霉素利多卡因凝胶进行微生物限度检查的方法适用性试验研究, 根据产品特性消除其抑菌活性, 建立微生物限度检查方法, 用于药品质量控制和标准提高。
1 实验材料及仪器 1.1 药品林可霉素利多卡因凝胶, 规格:10 g:50 mg(C18H34N2O6S)与40 mg(C14H22N2O·HCl), 批号C1512221, 上海司太立制药有限公司。
林可霉素利多卡因凝胶, 规格:20 g:0.175 g(C18H34N2O6S)与0.08 g(C14H22N2O·HCl), 批号170133, 上海新亚药业闵行有限公司。
1.2 菌种微生物限度检查法用标准菌株:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(CMCC(B)10104);金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(CMCC(B)26003);枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(CMCC(B)63501);白色念珠菌(Candida albicans)(CMCC(F)98001);黑曲霉(Aspergillus niger)(CMCC(F)98003);大肠埃希菌(Escherichia coli)(CMCC(B)44102), 均购自中国食品药品检定研究院。
1.3 实验仪器FEDEGARI型高压蒸汽灭菌器(意大利FEDEGARI公司), Steritest equinox集菌仪(默克密理博有限公司), 一次性薄膜过滤器FC752(浙江泰林生物技术股份有限公司), 培养箱(三洋电机(中国)有限公司), BSA 2202S电子天平(赛多利斯工业称重设备(北京)有限公司), ESCO MSC Advantage生物安全柜(赛默飞世尔科技(上海)有限公司)。
1.4 试剂氯化钡(批号:20151201, 上海凌峰化学试剂有限公司); 0.9%无菌氯化钠溶液(批号:20151010, 上海凌峰化学试剂有限公司)。
1.5 培养基pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号:3302098, 广东环凯微生物科技有限公司); 胰酪大豆胨琼脂培养基(批号:4090289), 沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号:5091514), 以上均为符合药典规定的干燥培养基。溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板(批号:BD90CA161021-1)、甘露醇氯化钠琼脂培养基平板(批号:SS90MSA161108-2)(广东环凯微生物科技有限公司, 批号:E1322Y), 以上为购买的成品培养基。
2 方法和结果 2.1 菌液的制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中, 33 ℃培养24 h; 接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖体液体培养基中, 23 ℃培养3 d, 上述培养物用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中, 23 ℃培养7 d, 加入含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液5 mL, 制成适宜浓度的菌悬液。
2.2 供试液的制备 2.2.1 A供试液取林可霉素利多卡因凝胶供试品10 g, 加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL, 充分振摇混匀, 作为1:10的供试液(A供试液)。
2.2.2 B供试液取林可霉素利多卡因凝胶供试品10 g, 加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(含3%硫酸镁)至100 mL, 充分振摇混匀, 作为1:10的供试液(B供试液)。
2.2.3 C供试液取林可霉素利多卡因凝胶供试品10 g, 加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(含3%硫酸锰)至100 mL, 充分振摇混匀, 作为1:10的供试液(C供试液)。
2.2.4 D供试液取林可霉素利多卡因凝胶供试品10 g, 加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(含3%氯化钡)至100 mL, 充分振摇混匀, 自然沉淀5 min后, 取上部溶液作为1:10的供试液(D供试液)。
2.3 微生物计数方法适用性试验 2.3.1 需氧菌总数计数方法 2.3.1.1 常规平皿法试验组:取制备好的A供试液10 mL, 加入金黄色葡萄球菌菌液0.1 mL, 混匀, 使每1 mL供试液中含菌量不大于100 cfu, 取上述供试液1 mL, 立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。同法制备含枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液, 各取1 mL至平皿中, 立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。再分别取白色念珠菌和黑曲霉的菌悬液1 mL至平皿中, 立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。每种菌悬液各平行制备2个平皿。
供试品对照组:取制备好的供试液, 用稀释液代替菌液同试验组操作。
菌液对照组:取稀释液替代供试液, 按试验组操作加入试验菌并进行回收试验。
试验结果分析:金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值均小于0.5, 说明该方法可以用于霉菌和酵母菌总数计数, 但无法有效检测林可霉素利多卡因凝胶的需氧菌总数, 必须重新建立新的需氧菌总数计数方法。结果见表 1。
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表 1 常规平皿法用于需氧菌总数计数测定结果(n=1) Table 1 Recovery of validation strains in the total aerobic microbial count test(routine method of pourplate culture) |
试验组:分别取B、C供试液9.9 mL, 加入金黄色葡萄球菌菌液0.1 mL, 使每1 mL的供试液含有不大于100 cfu的试验菌, 取含菌的供试液1 mL, 薄膜过滤后, 用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL冲洗, 每次100 mL, 过滤后, 转移滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上, 平行制备2个平板。枯草芽孢杆菌同法操作。
取D供试液9.9 mL, 加入金黄色葡萄球菌菌液0.1 mL, 使每1 mL的供试液含有不大于100 cfu的试验菌, 取含菌的供试液1 mL, 薄膜过滤后, 用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL冲洗, 每次100 mL, 过滤后, 转移滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上, 平行制备2个平板。枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉同法操作。
供试品对照组:取准备好的供试液, 以稀释液代替菌液同试验组操作。
菌液对照组:取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液代替供试液, 按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。
稀释剂对照组:取相应量稀释液替代供试品同试验组操作。
试验结果分析:使用B供试液时金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌回收率较低, 使用C供试液时供试液中的黄色絮状物体会影响膜过滤效率。使用D供试液时5种试验菌试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值均在0.5~2之间。因此, 薄膜过滤法用于林可霉素利多卡因凝胶需氧菌总数计数符合2015年版中国药典四部通则1105的要求。结果见表 2和表 3。
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表 2 B和C供试液用于需氧菌总数计数测定结果 Table 2 Recovery of validation strains in total aerobic microbial count test(B、C sample) |
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表 3 D供试液用于需氧菌总数计数测定结果(n=3) Table 3 Recovery of validation strains in total aerobic microbial count test(D sample) |
试验组:分别取1:10的供试液10 mL, 加入试验菌菌液0.1 mL, 混匀, 使每1 mL供试液中含菌量不大于100 cfu。取上述制备好的供试液1 mL, 立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基, 平行制备2个平板。
供试品对照组:取准备好的供试液, 以稀释液代替菌液, 同试验组操作。
菌液对照组:取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液代替供试液, 按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。
试验结果分析:5种试验菌试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值均在0.5~2之间。因此, 常规平皿法用于林可霉素利多卡因凝胶霉菌和酵母菌总数计数符合2015年版中国药典四部的要求。结果见表 4。
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表 4 常规平皿法用于霉菌和酵母菌总数计数测定结果(n=3) Table 4 Recovery of validation strains in total yeast and mould microbial count test(membrane filtration method) |
分别取B供试液10 mL, 按照薄膜过滤法全量过滤后, 用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次, 每次100 mL, 在最后1次的冲洗液中加入不大于100 cfu的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌液, 过滤后, 取出滤膜分别接入100 mL的胰酪大豆胨液体培养基中, 混匀, 33 ℃培养18 h。
取胰酪大豆胨液体培养物接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板和溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上, 33 ℃培养18 h, 均可见典型菌落。
阴性对照组:以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查, 阴性对照试验无菌生长。
试验结果分析:阳性对照组控制菌能检出, 阴性对照组和供试品对照组均未检出, 因此, 本品采用上述方法能检出控制菌。结果见表 5。
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表 5 控制菌检查方法适用性试验结果 Table 5 Validation result of specified microorganisms |
可霉素利多卡因凝胶主要对细菌有较强抗菌活性, 当凝胶剂中加入具有抑菌作用的物质时, 对其进行微生物限度检查需用薄膜过滤法, 但卡波姆在稀释液中会形成胶体溶液, 无法通过微孔滤膜(孔径0.45 μm), 从而导致薄膜过滤法无法正常进行, 故应先用适宜的方法去除卡波姆[5]。
3.2 稀释液的选择文献报道硫酸锰溶液可消除保妇康抑菌凝胶的抑菌活性[5], 硫酸镁溶液可消除硫酸新霉素凝胶的抑菌活性[8]。本研究中也将硫酸锰溶液和硫酸镁溶液作为稀释液测试敏感菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率:将硫酸镁溶液作为稀释液时, 枯草芽孢杆菌的未收率小于0.5, 金黄色葡萄球菌的回收率虽然达到要求, 但回收率偏低; 使用硫酸锰溶液作为稀释液, 在制备的供试液中形成了黄色的絮状物质, 影响薄膜过滤效率, 较难采用薄膜过滤法进行试验。因此硫酸锰溶液和硫酸镁溶液并不适用于林可霉素利多卡因凝胶的微生物限度检查。
3.3 小结本文利用氯化钡与凝胶中的卡波姆(丙烯酸交链聚合物)结合形成钡盐沉淀, 从而达到破胶的目的。自然沉降去除沉淀物后, 上部溶液可以顺利通过微孔滤膜, 经冲洗后, 可有效去除林可霉素利多卡因凝胶的抑菌作用。该类方法为含抗感染药物凝胶制剂的微生物检查方法的研究提供参考。
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