咳速停糖浆作为特色苗药, 其处方包括罂粟壳、麻黄、百尾参、虎耳草、吉祥草、桔梗、桑白皮、黄精、枇杷叶9味药材, 具有补气养阴、润肺止咳、益胃生津的功效, 主要用于感冒及急、慢性支气管炎引起的咳嗽及咽干、咳痰、气喘等症。处方中的麻黄具有发汗散寒、宣肺平喘、利水消肿的作用, 盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱作为麻黄的主要有效特征成分^[1], 属于拟肾上腺类药物, 是国家规定需要严格控制的毒麻类成分^[2]；又由于该制剂中含有麻醉药品罂粟壳, 若对其用量控制不当, 久服易成瘾, 其主要成分为吗啡、磷酸可待因、盐酸罂粟碱, 可用于止痛、止咳^[3-4], 三者均为罂粟壳中的有效成分, 同时也属于强成瘾性成分^[5]。2味药材中含有的5个生物碱是咳速停糖浆治疗感冒及咳嗽、气喘等症的主要有效成分, 为了确保制剂的安全性及有效性, 必须控制其含量。目前, 已有大量文献报道^[6-17]麻黄、罂粟壳及其不同制剂的含量测定, 其中罗奕等^[18]采用HPLC法同时测定咳速停胶囊中4个成分含量, 刘绪林等^[19]采用离子对色谱法测定咳速停颗粒中吗啡的含量, 朱平川等^[20]采用UPLC-MS/MS法测定速停糖浆中3种兴奋剂类生物碱, 左琳等^[21]采用HPLC法测定咳速停糖浆中盐酸麻黄碱的含量。

咳速停糖浆的现有质量标准^[22]中只对吉祥草、桔梗、桑白皮3味药材进行薄层鉴别, 含量测定项中仅对罂粟壳中的吗啡及麻黄中的盐酸麻黄碱进行测定。其质量标准简单, 无法控制产品的质量, 确保临床用药安全、有效。因此, 本实验采用HPLC法测定咳速停糖浆中5个生物碱(吗啡、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、磷酸可待因、盐酸罂粟碱)含量, 以完善、提升咳速停糖浆的质量控制水平。同时, 本实验简化了样品前处理及色谱条件。

1 仪器、试剂与试药 1.1 仪器

岛津公司LC-20AD高相液相色谱仪(DAD检测器, LC solution软件工作站), 月旭科技(上海)股份有限公司Welch Ultimate^®AQ-C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm；填料:十八烷基硅烷键合硅胶), 北京科伟永兴仪器有限公司HH-6型电热恒温水浴锅, 梅特勒-托利多仪器上海有限公司XS105DU型电子分析天平。

1.2 试剂与试药

吗啡(批号171201-201123)、盐酸麻黄碱(批号171241-201508)、盐酸伪麻黄碱(批号171237-200807)、磷酸可待因(批号171203-201005)、盐酸罂粟碱(批号171214-200404)均购买于中国食品药品检定研究院；磷酸、乙腈、甲醇为色谱纯, 其他试剂均为分析纯, 水为超纯水；10批咳速停糖浆、9味药材(吉祥草、百尾参、枇杷叶、虎耳草、桔梗、黄精、麻黄、桑白皮、罂粟壳)均由贵州百灵有限公司提供, 药材由贵州省食品药品检验所中药标本馆李杨老师鉴定, 根据处方自制阴性样品。

2 方法和结果 2.1 溶液制备 2.1.1 对照品储备液

精密称取吗啡0.003 74 g, 置于10 mL量瓶中, 盐酸麻黄碱0.005 06 g, 置于5 mL量瓶中, 盐酸伪麻黄碱0.009 36 g, 置于5 mL量瓶中, 磷酸可待因0.003 58 g, 置于20 mL量瓶中, 盐酸罂粟碱0.000 79 g, 置于20 mL量瓶中, 分别加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 制得吗啡374 µg·mL^-1, 盐酸麻黄碱1 012 µg·mL^-1, 盐酸伪麻黄碱1 872 µg·mL^-1, 磷酸可待因179 µg·mL^-1, 盐酸罂粟碱39.5 µg·mL^-1的溶液, 即得各个对照品储备液。

2.1.2 混合对照品储备液

精密吸取“2.1.1”项下的各对照品储备液均1 mL, 置于同一25 mL量瓶中, 加入0.1%磷酸水溶液稀释定容至刻度, 摇匀, 制得吗啡14.96 µg·mL^-1, 盐酸麻黄碱40.48 µg·mL^-1, 盐酸伪麻黄碱74.88 µg·mL^-1, 磷酸可待因7.16 µg·mL^-1, 盐酸罂粟碱1.58 µg·mL^-1的混合溶液, 即得。

2.1.3 供试品溶液

准确量取咳速停糖浆10 mL, 置125 mL分液漏斗中, 加入氨水3 mL, 振摇1 min后加乙酸乙酯振摇提取3次, 每次15 mL, 合并上层溶液, 水浴挥干, 残渣加0.1%磷酸水溶液定容至10 mL量瓶中, 摇匀, 过0.45 μm滤膜, 即得。

2.1.4 阴性样品溶液

分别准确量取缺麻黄药材、缺罂粟壳药材的阴性样品各10 mL, 按“2.1.3”项下方法制备阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

采用Welch Ultimate^®AQ-C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 以乙腈为流动相A, 0.1%磷酸水溶液为流动相B, 梯度洗脱(0~15 min, 4%A；15~30 min, 4%A→10%A；30~60 min, 10%A→40%A), 流速1.0 mL·min^-1, 柱温35 ℃, 吗啡、麻黄碱、伪麻黄碱、可待因检测波长为210 nm, 罂粟碱检测波长为250 nm, 进样量10 μL。

2.3 系统适用性试验

取供试品溶液、混合对照品溶液及阴性样品溶液分别按“2.2”项下色谱条件进样测定, 结果在供试品溶液和混合对照品溶液的色谱图中吗啡、麻黄碱、伪麻黄碱、可待因、罂粟碱的色谱峰均在60 min内即可达到基线分离, 且所对应的分离度分别为1.600、3.665、1.707、2.777、2.559, 理论塔板数均大于7 500, 且各色谱峰峰形较好, 阴性样品溶液色谱图中未出现待测成分峰, 见图 1。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.1.2”项下混合对照品储备液0.3、0.7、1、1.5、2.0、2.5 mL, 分别置于5 mL量瓶中, 加入0.1%磷酸水溶液定容至刻度, 即得系列浓度的混合对照品溶液, 按“2.2”项下色谱条件进行测定, 记录各色谱峰峰面积。以质量浓度(µg·mL^-1)为横坐标, 峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线, 分别得吗啡、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、磷酸可待因、盐酸罂粟碱的回归方程及线性范围, 见表 1。

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液, 按“2.2”项下色谱条件连续进样6次, 记录各色谱峰峰面积。分别计算吗啡、麻黄碱、伪麻黄碱、可待因、罂粟碱峰面积的RSD分别为0.84%、0.41%、0.90%、0.32%、0.31%, 表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验

分别准确量取咳速停糖浆(批号20150610)10 mL, 6份, 按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液, 按“2.2”项下色谱条件分别进行测定, 记录各色谱峰的峰面积。分别计算吗啡、麻黄碱、伪麻黄碱、可待因、罂粟碱含量的RSD分别为2.0%、1.6%、2.9%、1.9%、3.0%, 表明该方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验

准确量取咳速停糖浆(批号20150610)10 mL, 按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液, 按“2.2”项下色谱条件分别在0、3、5、9、15、24 h内测定同一供试品溶液, 记录各色谱峰面积。分别计算吗啡、麻黄碱、伪麻黄碱、可待因、罂粟碱峰面积的RSD分别为1.2%、0.92%、1.2%、1.1%、0.44%, 表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

分别准确量取咳速停糖浆(批号20150610)适量, 9份, 分为3组, 每组3份, 每组分别精密加入相当于样品含量50%、100%、150%的混合对照品溶液, 按“2.1.3”项下方法分别制备低、中、高不同浓度的供试溶液, 按“2.2”项下色谱条件分别进行测定, 记录各色谱峰面积。分别计算不同浓度的加样回收率及RSD, 结果见表 2。

2.9 咳速停糖浆中5个生物碱的含量测定

分别准确量取同一厂家10个不同批号的咳速停糖浆10 mL, 每批样品取3份, 按“2.1.3”项下方法分别制备供试品溶液, 按“2.2”项下色谱条件分别进行测定, 记录各色谱峰峰面积。按“2.4”项下线性回归方程分别计算5个生物碱的含量, 见表 3。

3 讨论 3.1 流动相的优化

通过查阅相关文献资料^{[6, 18, 21]}, 本实验主要考察了乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.01 mol·L^-1磷酸二氢钾缓冲液(含0.1%磷酸)、甲醇-0.1%磷酸水3种流动相。实验结果表明, 甲醇-0.1%磷酸水不能洗脱出5个生物碱。乙腈-0.01 mol·L^-1磷酸二氢钾缓冲液(含0.1%磷酸)不利于罂粟碱的分离。乙腈-0.1%磷酸水各色谱峰的分离度均大于1.5, 且各色谱峰的峰形好；在考察磷酸溶液浓度的过程中发现, 酸度对麻黄碱和伪麻黄碱的峰形影响较大, 2个有效成分在0.05%磷酸水条件下色谱峰形差, 0.2%磷酸水与0.1%磷酸水无明显差别, 由于考虑到色谱柱的耐酸程度, 故选择乙腈-0.1%磷酸水作为流动相。

3.2 检测波长的考察

通过DAD检测器进行全波长扫描, 发现吗啡、麻黄碱、伪麻黄碱、可待因、罂粟碱分别在209、207、206、211、251 nm波长处具有最大吸收, 考虑末端吸收因素, 选择对比220 nm与210 nm吸收波长处前4个生物碱的峰面积, 结果表明前4个成分在210 nm处响应值大于220 nm处, 且灵敏度高, 通过参考相关文献及资料^[6], 最终确定210 nm作为检测波长；罂粟碱虽在251 nm下有最大吸收, 但其在250 nm下响应值最大, 在这2个波长下, 罂粟碱的分离度及灵敏度无明显区别, 考虑准确定量罂粟碱在本品中的含量, 最终确定250 nm作为罂粟碱的检测波长。

3.3 供试品溶液萃取溶剂的优化

本实验考察了三氯甲烷、乙酸乙酯、三氯甲烷-氨水、乙酸乙酯-氨水作为萃取溶剂的萃取效果, 结果发现, 不加氨水不利于5个生物碱的萃取, 三氯甲烷-氨水的萃取率并无明显高于乙酸乙酯-氨水, 鉴于减轻试剂对试验人员的危害程度, 确定乙酸乙酯-氨水作为萃取溶剂；氨水用量增加, 对5个生物碱的萃取效果有所增益, 但氨水用量增加到一定程度后, 萃取率无明显变化。试验过程中, 考察了1、2、3、5 mL氨水用量, 最终确定供试品萃取溶剂—氨水的用量为3 mL。