建立RP-HPLC法同时测定复合维生素注射液中11种维生素含量

成分分析

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潘瑶, 唐建华, 龙必强, 苏玲, 毕海林, 肖裕章, 胡军. 建立RP-HPLC法同时测定复合维生素注射液中11种维生素含量[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(3): 443-449. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.03.10.

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PAN Yao, TANG Jian-hua, LONG Bi-qiang, SU Ling, BI Hai-lin, XIAO Yu-zhang, HU Jun. Simultaneous determination of 11 kinds of vitamins in compound vitamin injection by RP-HPLC[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2018, 38(3): 443-449. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.03.10.

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第一作者

潘瑶, Tel:17623352481;E-mail:1113290334@qq.com。

通信作者

唐建华, Tel:(023)46788067;E-mail:1113290334@qq.com

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修改日期：2017-12-26

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建立RP-HPLC法同时测定复合维生素注射液中11种维生素含量

潘瑶 ^1,2, 唐建华 ^1,2, 龙必强 ³, 苏玲 ^1,2, 毕海林 ², 肖裕章 ², 胡军 ^1,2

1. 西南大学荣昌校区动物医学系, 荣昌 402460;
2. 重庆方通动物药业有限公司, 荣昌 402460;
3. 重庆市计量质量检测研究院, 重庆 400000

修改日期：2017-12-26

第一作者：潘瑶, Tel:17623352481;E-mail:1113290334@qq.com

通信作者：唐建华, Tel:(023)46788067;E-mail:1113290334@qq.com

摘要：目的：建立同时测定复合维生素注射液中11种维生素含量的RP-HPLC方法。方法：采用十八烷基键合硅胶为填料（250 mm×4.6 mm，5 μm）的色谱柱，以0.1 mol·L^-1的醋酸钠溶液-甲醇为流动相梯度洗脱，变化流速，联合紫外检测器的程序变化波长，进样量20 μL，柱温35℃。结果：维生素A、维生素D₃、维生素E、维生素C、维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆、维生素B₁₂、烟酸、烟酰胺、叶酸分别在0.272 8~2.728、0.012 4~0.124、1.032 7~10.327、1.131 0~11.310、2.282 8~22.828、0.194 8~1.948、1.016 5~10.165、0.235 8~2.358、1.085 4~10.854、2.168 1~21.681和0.369 4~3.694 μg呈良好的线性关系（r>0.999）；平均加样回收率（n=9）分别为100.0%、104.2%、100.9%、98.9%、100.4%、100.7%、100.1%、99.2%、100.2%、99.8%和100.5%，其RSD（n=9）分别为0.21%、0.02%、1.8%、1.0%、1.2%、0.35%、0.52%、2.8%、0.12%、0.05%和3.6%；精密度的RSD（n=6）分别为0.38%、0.11%、0.07%、0.15%、0.23%、0.06%、0.28%、0.22%、0.05%、0.41%、0.15%；重复性试验的RSD（n=6）分别为0.13%、0.78%、1.2%、2.2%、0.26%、1.5%、1.8%、1.3%、0.69%、0.94%和0.36%；样品平均含量分别为0.839、0.103、0.434、0.331、0.944、0.107、0.467、0.0043、0.134、0.958和0.013 μg·μL^-1。结论：本方法适用于复合维生素注射液中维生素A、维生素D₃、维生素E、维生素C、维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆、维生素B₁₂、烟酸、烟酰胺、叶酸的含量测定。

关键词：脂溶性维生素水溶性维生素高效液相色谱法梯度洗脱程序变化波长

Simultaneous determination of 11 kinds of vitamins in compound vitamin injection by RP-HPLC

PAN Yao^1,2, TANG Jian-hua^1,2, LONG Bi-qiang³, SU Ling^1,2, BI Hai-lin², XIAO Yu-zhang², HU Jun^1,2

1. Rongchang Campus of Southwest University, Rongchang 402460, China;
2. Chongqing Fangtong Animal Pharmaceutical Co., LTD, Rongchang 402460, China;
3. Chongqing Institute of Metrology and Quality Inspection, Chongqing 400000, China

Abstract: Objective: To established a method for simultaneous determination of eleven vitamins in compound vitamin injection byRP-HPLC.Method: The RP-HPLC was performed on C₁₈ column(250 mm×4.6 mm, 5 μm).The mobile phase consisted of 0.1 mol·L^-1 sodium acetate solution-methanol with the linear gradient elution, the changed flow rate, and changed wavelength of UV spectra, 20μL was injected.The column temperature was 35℃.Results: vitamin A, vitamin D₃, vitamin E, thiamine, vitaminB₂, vitamin B₆, vitamin B₁₂, nicotinic acid, nicotinamide, folic acid had a good linearity among the ranges of 0.272 8-2.728, 0.012 4-0.124, 1.032 7-10.327, 1.131 0-11.310, 2.282 8-22.828, 0.194 8-1.948, 1.016 5-10.165, 0.235 8-2.358, 1.085 4-10.854, 2.168 1-21.681 and 0.369 4-3.694 μg, respectively; The average recoveries(n=9)were 100.0% with RSD of 0.21%, 104.2% with RSD of 0.02%, 100.9% with RSD of 1.8%, 98.9% with RSD of 1.0%, 100.4% with RSD of 1.2%, 100.7% with RSD of 0.35%, 100.1% with RSD of 0.52%, 99.2% with RSD of 2.8%, 100.2% with RSD of 0.12%, 99.8% with RSD of 0.05%, 100.5% with RSD of 3.6%, respectively. The RSDs of precisions were 0.38%, 0.11%, 0.07%, 0.15%, 0.23%, 0.06%, 0.28%, 0.22%, 0.05%, 0.41%, 0.15%;the RSDs of repeatibility were 0.13%, 0.78%, 1.2%, 2.2%, 0.26%, 1.5%, 1.8%, 1.3%, 0.69%, 0.94%, 0.36%, respectively; the average content was 0.839, 0.103, 0.434, 0.331, 0.944, 0.107, 0.467, 0.004 3, 0.134, 0.958 and 0.013 μg·μL^-1, respectively.Conclusion: This method can be used for simultaneous determination of vitamin A, vitamin D₃, vitamin E, thiamine, vitamin B₂, vitamin B₆, vitamin B₁₂, nicotinic acid, nicotinamide, folic acid in compound vitamin injection.

Key words: fat-soluble vitamin water-soluble vitamin high performance liquid chromatography gradient elution wavelength of procedure changed

维生素是一类人与动物正常生长必须的有机化合物，尤其在人与动物的妊娠、泌乳、生长期以及疾病均需维生素的补充^[1]。维生素主要根据溶解情况被分为水溶性维生素（维生素C和维生素B族）和脂溶性维生素（维生素A、D、E和K），但人与动物机体自身无法合成维生素，因此需要食物和维生素的相关制剂给予补充^[2]，如常见的多种维生素片、维生素口服液及注射液等^[3]。维生素对光照、温度等因素稳定性差，因此建立有效控制维生素补充制剂的质量方法显得尤为重要。目前维生素测定方法紫外分光光度法、荧光分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、微生物法等^[4-5]，但多为单独分析水溶性维生素或脂溶性维生素，同时测定多种脂溶性和水溶性维生素的文献报道较少^[6]，王希希^[7]建立了高效液相色谱法同时分析食品、多维片和饮料中12种维生素的方法，可注射液质量控制方法暂未见报道。多种维生素注射液可通过肌肉注射有效地补充不同时期动物和患病动物所需的维生素，但因维生素在溶液状态下不稳定的特点，本研究建立了反相高效液相色谱法同时测定动物用多种维生素注射液中11种维生素，为多种维生素的质量控制和稳定性研究提供检测依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

高效液相色谱仪（Waters e2695），Uranus色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Thenomenex公司）；紫外分光光度计（Waters UV 2489）；万分之一电子天平（CPA225D，赛外利斯科学仪器（北京）有限公司）；超声波清洗仪（KQ5200DE，昆明市超声仪器有限公司）；天平（JA5003N，上海精密仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品维生素A（纯度99.0%）、维生素E（纯度97.9%）、维生素B₂（纯度99.0%）、维生素B₂（纯度99.0%）购于Sigma公司；对照品维生素D₃（纯度99.0%，100061201208）、维生素C（纯度99.8%，100425-201103）、维生素B₁（纯度97.0%100390-201505）、维生素B₆（纯度100.0%，100116-200404），维生素B₁₂（纯度98.0%，100112-201306）、烟酸（纯度99.0%，100213-201209）、烟酰胺（纯度98.0%，100115-200703）、叶酸（纯度92.3%，100074201214）购于中国食品药品检定研究院；醋酸乙酯（重庆川东化工（集团）有限公司）及吐温-80（成都市科龙化工试剂厂）为分析纯甲醇（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）及无水醋酸钠（天津市大茂化学试剂厂）为色谱纯。样品复合维生素注射液由HeBei Animal Health Care Science And Technology Co. Ltd.提供，批号为122065。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

采用Uranus色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.1 mol·L^-1醋酸钠溶液-甲醇，梯度洗脱（见表 1），紫外检测器的程序变化波长见表 2，柱温为35 ℃，进样量20 μL。

表 1 梯度洗脱时间表 Table 1 Gradient elution schedule

表 2 梯度波长时间表 Table 2 Gradient wavelength schedule

2.2 对照品溶液的制备 2.2.1 脂溶性对照品储备液

按照处方比例，精密称取各个脂溶性维生素对照品适量（维生素A 334 mg、维生素D₃ 2.5 mg、维生素E 200 mg），置100 mL量瓶中，加入醋酸乙酯5 mL溶解，加入吐温80，10 mL摇匀，用0.1 mol·L^-1醋酸钠溶液稀释至刻度线，摇匀，避光保存备用。

2.2.2 维生素C对照品溶液

精密称取维生素C对照品约125 mg，置50 mL量瓶中，加入0.1 g· L^-1盐酸半胱氨酸作为抗氧剂，用0.1 mol·L^-1醋酸钠溶液定容至刻度线，摇匀备用。

2.2.3 混合对照品溶液

精密称定水溶性维生素对照品适量（维生素B₁ 50 mg、维生素B₁₂ 5 mg、维生素B₆ 25 mg、维生素B₂ 5 mg、烟酰胺50 mg、烟酸25 mg、叶酸7.5 mg），置于100 mL量瓶中，用0.1 mol· L^-1醋酸钠溶液50 mL溶解，精密加入脂溶性对照品储备液和维生素C对照溶液各10 mL，用0.1 mol·L^-1醋酸钠溶液稀释至刻度线，摇匀，避光保存，备用。

2.3 供试品溶液的制备

精密吸取复合维生素注射液5 mL，置于100 mL量瓶中，用0.1 mol·L^-1醋酸钠溶液定容至刻度线作为供试品溶液。

2.4 阴性溶液的制备

按复合维生素注射液处方比例准确称取除维生素A以外的维生素按照复合维生素注射液配制工艺制成缺失维生素A的阴性样品；同法分别制得缺维生素C、烟酸、维生素B₁、维生素B₆、烟酰胺、叶酸、维生素B₁₂、维生素B₂、维生素D₃、维生素E阴性样品，按“2.3”项方法制成阴性溶液备用。在上述色谱条件下，对照品、样品的色谱图见图 1。

1.维生素C（vitamin C）2.烟酸（nicotinic acid）3.维生素B₁（vitamin B₁）4.维生素B₆（vitamin B₆）5.烟酰胺（niacinamide）6.叶酸（folic acid）7.维生素B₂（vitamin B₂）8.维生素B₁₂（vitamin B₁₂）9.维生素D₃（vitamin D₃）10.维生素E（vitamin E）11.维生素A（vitamin A）图 1 混合对照品（A）、复合维生素注射液（B）色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances(A), compound vitamin injection(B)

2.5 专属性试验

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各20 μL，在“2.1”项色谱条件下分别进样，得相应的色谱图，对照品及供试品见图 1。样品色谱图中，在维生素C、烟酸、维生素B₁、维生素B₆、烟酰胺、叶酸、维生素B₁₂、维生素B₂、维生素D₃、维生素E、维生素A对照品相应保留时间处，有相应的色谱峰；阴性样品色谱图中，在上述除阴性样品中缺失的维生素外，其余各维生素与相应对照品出峰时间一致。说明复合维生素注射液中各成分测定无干扰，方法专属。

2.6 线性关系考察

精密吸取各对照品溶液5、10、20、30、40、50 μL，分别注入色谱仪，记录峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果（表 3）表明进样量（μg）在一定范围内与峰面积呈良好的线性关系。

表 3 各维生素的回归方程、相关系数和线性范围 Table 3 Regression equation, correlation coefficient and linear range of each vitamin

2.7 精密度试验

精密吸取各对照品溶液20 μL，连续进样6次，记录峰面积，计算维生素A、维生素E、维生素D₃、维生素C、烟酸、维生素B₁、维生素B₆、烟酰胺叶酸维生素B₁₂、维生素B₂峰面积的RSD（n=6）分别为0.38%、0.07%、0.11%、0.15%、0.05%、0.23%、0.28%、0.41%、0.15%、0.22%、0.06%均符合要求。

2.8 重复性试验

取同一批复合维生素注射液6份，按照“2.3”项方法下制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件分别进行测定，记录峰面积，计算维生素A、维生素E、维生素D₃、维生素C、烟酸、维生素B₁、维生素B₆、烟酰胺、叶酸、维生素B₁₂、维生素B₂峰面积的RSD（n=6）分别为0.13%、1.2%、0.78%、2.2%、0.69%、0.26%、1.8%、0.94%、0.36%、1.3%、1.5%，表明本方法准确度良好。

2.9 稳定性试验

精密吸取供试品溶液20 μL，分别在第0、2、4、6、8、12 h进行测定，记录峰面积，计算维生素A、维生素D₃、维生素E、维生素C、维生素B₁、维生素B₆、维生素B₁₂、维生素B₂、烟酸、烟酰胺、叶酸峰面积分别为0.37%、1.1%、0.64%、0.87%、0.54%、0.52%、0.61%、1.3%、0.36%、0.65%、0.26%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验

分别精密量取已知含量的复合维生素注射液样品10 mL共9份，平均分为3组，分别精密加入混合对照品溶液各8 mL（80%）、10 mL（100%）、12 mL（120%），每个浓度各平行操作3组，用0.1 mol·L^-1醋酸钠溶液定容至刻度线，制成新的供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表 4，结果表明该方法的回收率良好。

表 4 回收率试验结果（n=3） Table 4 Results of recovery test

组分（component）		浓度（concentration）/（μg·μL^-1）	加入量（added）/（μg·μL^-1）	测定量（found）/（μg·μL^-1）	回收率（recovery）/%	RSD/%
维生素C（vitamin C）	80%	0.5946	0.199 6	0.794 7	98.8	1.0
	100%		0.253 1	0.847 0	99.3
	120%		0.305 3	0.899 4	98.7
烟酸（nicotinic acid）	80%	0.3561	0.195 4	0.551 5	99.9	0.12
	100%		0.248 8	0.601 5	100.3
	120%		0.294 6	0.650 6	100.4
维生素B₁（vitamin B₁）	80%	0.6873	0.386 2	1.073 4	101.3	1.2
	100%		0.476 4	1.163 6	100.1
	120%		0.570 8	1.258 3	99.9
维生素B₆（vitamin B₆）	80%	0.3357	0.200 2	0.535 7	99.7	0.52
	100%		0.249 3	0.584 5	99.2
	120%		0.297 4	0.632 7	98.7
烟酰胺（nicotinamide）	80%	0.6845	0.399 2	1.083 7	99.9	0.05
	100%		0.498 7	1.183 2	99.8
	120%		0.593 7	1.281 3	99.6
叶酸（folic acid）	80%	0.1129	0.058 9	0.171 5	102.1	3.6
	100%		0.076 5	0.188 9	99.9
	120%		0.093 4	0.202 4	99.5
维生素B₁₂（vitamin B₁₂）	80%	0.0674	0.051 3	0.111 4	100.4	2.8
	100%		0.054 2	0.121 4	98.7
	120%		0.066 5	0.133 8	101.2
维生素B₂（vitamin B₂）	80%	0.0782	0.039 2	0.117 5	101.2	0.35
	100%		0.048 6	0.126 8	100.2
	120%		0.088 7	0.136 8	100.7
维生素D₃（vitamin D₃）	80%	0.0058	0.002 7	0.008 5	104.1	0.02
	100%		0.003 6	0.009 2	104.2
	120%		0.004 1	0.009 8	104.3
维生素E（vitamin E）	80%	0.3485	0.172 8	0.521 1	101.9	1.8
	100%		0.212 1	0.561 7	100.7
	120%		0.253 8	0.602 4	100.0
维生素A（vitamin A）	80%	0.5096	0.272 6	0.782 1	99.8	0.21
	100%		0.341 1	0.850 8	99.9
	120%		0.410 9	0.920 8	100.4

表 4 回收率试验结果（n=3） Table 4 Results of recovery test

2.11 样品测定

分别取3批复合维生素注射液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定各成分含量，结果见表 5。

表 5 样品测定结果(μg·μL^-1, n=3) Table 5 Determination results of the samples

3 讨论 3.1 检测波长的选择

本研究对8种水溶性维生素和3种脂溶性维生素进行同时分析，各个维生素化学性质和结构差异大，吸收度有明显差异^[8]，故检测波长也应根据维生素的洗脱时间进行变化^[9]。分别取11种维生素对照品溶液在200~400 nm之间进行全波长扫描，结果显示：维生素C、烟酸、维生素B₁、烟酰胺、维生素B₂、维生素D₃均在（266±1）nm有最大吸收；维生素B₆在291 nm有最大吸收；叶酸在278 nm有最大吸收；维生素B₁₂在360 nm有最大吸收；维生素A在325 nm有最大吸收波长；维生素E在295 nm有最大吸收波长，与文献报道^{[8, 10-11]}一致。由于维生素B₁和维生素B₆保留时间接近，无法进行波长切换^[13]，所以维生素C、烟酸、维生素B₁、维生素B₆、烟酰胺选择266 nm进行检测；叶酸、维生素B₁₂、维生素B₂分离时间间隔较短，采用280 nm进行测定；维生素A、维生素E、维生素D₃保留时间间隔大，故采用各自最大吸收波长进行检测。本研究采用的检测波长与王希希等^[7]、宋萍萍等^[10]、I Karaca等^[9]研究报道一致。

3.2 流动相的选择

高效液相色谱法分析维生素的多采用离子对试剂^[12]或甲醇-缓冲溶液体系^[13]作为流动相，离子对不仅价格偏高，且对色谱柱造成不可逆损坏，导致柱效下降，故被尽量少地使用^[14]；甲醇-缓冲液体系常被用于分析多种维生素，其中以甲醇-磷酸盐缓冲体系最常用^[15-17]，然而磷酸盐为无机盐，不溶于甲醇^[18]，因此在进行梯度洗脱时，随着甲醇浓度升高时，磷酸盐的溶解度下降，从而导致柱压变大，检测基线不稳定，灵敏度下降，即使通过以高比例的水相进行过渡以避免无机盐的析出问题，但最终得到的色谱结果并不理想^[19]。本研究通过预试验选择无水醋酸钠与冰乙酸构建的缓冲体系，无水醋酸钠为有机盐溶于甲醇中，有效解决在梯度洗脱时高浓度甲醇下盐的析出问题，洗脱过程中甲醇比例直接上升到100%时系统仍然非常稳定。本研究通过对0.05 mol·L^-1、0.1 mol·L^-1的醋酸钠进行比较发现：采用0.05 mol·L^-1乙酸钠时，各水溶性维生素保留时间延长，且分离度不及0.1 mol·L^-1的醋酸钠溶液。0.1 mol·L^-1乙酸钠对8种水溶性维生素完好分离，且保留时间适宜，最终确定采用0.1 mol·L^-1醋酸钠缓冲液进行洗脱；经过对流动相不同比例的考察发现：当甲醇初始含量为5%时，前10 min即可对维生素C、烟酸、维生素B₁、维生素B₆、烟酰胺5种维生素分离良好；叶酸、维生素B₂、维生素B₁₂分离度随着甲醇量的增加而增大，甲醇比例在10~18 min之间达到45%时以上3种维生素的分离度最佳；脂溶性维生素需要高浓度的甲醇进行洗脱^[23]，18~50 min采用全甲醇进行等度洗脱，维生素D₃、维生素A、维生素E完好分离。

3.2 流动相pH选择

以甲醇和0.1 mol·L^-1醋酸钠缓冲液为流动相梯度洗脱时，各维生素虽完全分离但出峰时间过长，因此本研究还考察了以冰醋酸为改性剂的流动相pH对试验的影响^[8]。发现当pH < 4.25时，各水溶性维生素的保留时间均提前，分离度达不到要求；当pH > 4.25时，维生素B₁与维生素B₆不能完全分离，并且各维生素的保留时间均延长；因此，当pH为4.25时达到良好的分离，选定流动相pH为4.25。

3.3 流速的选择

试验发现梯度过程中用1 mL·min^-1洗脱，水溶性维生素与脂溶性维生素完全洗脱需要1.5 h，脂溶性维生素与水溶性维生素保留时间相差，且各脂溶性维生素出峰保留时间相隔较长，因此将水溶性维生素洗脱出之后的流速分别提升至1.5、1.8、2 mL·min^-1进行比较，发现仅将该流速提升至1.5 mL·min^-1时，脂溶性维生素可完全分离且稳定性最佳，在50 min内11种维生素可全部出峰。

3.5 色谱柱的选择

使用RP-HPLC法测定维生素的各文献报道中^[20-22]，大多使用不同品牌的C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），本文考察了Kromasil C₁₈、Agilent C₁₈、Phenomenex C₁₈以及Uranus C₁₈色谱柱结果Uranus C₁₈色谱柱兼顾了分离度最佳且使用度高和价廉等优点。

4 结论

本文建立的反相高效液相色谱法简单易行，方法灵敏，专属性、重复性、回收率均符合要求，能够同时测定复合维生素注射液中的维生素C、维生素B₁、维生素B₆、维生素B₁₂、维生素B₂、烟酸、烟酰胺、叶酸、维生素A、维生素D₃、维生素E的含量。

参考文献

[1]	MARLEY EC, MACKAY E, YOUNG G. Characterisation vitamin B₁₂ immunoaffinity columns and method development for determination of vitamin B₁₂ in a range of foods, juices and pharmaceutical products using immunoaffinity clean-up and high performance liquid chromatography with UV detection[J]. Food Add Comtam, 2009, 26(3): 282. DOI:10.1080/02652030802429104
[2]	KIENEN V, COSTA WF, VISENTAINE JV, et al. Development of a green chromatographic method for determination of fat-soluble vitamins in food and pharmaceutical supplement[J]. Talanta, 2008, 75(1): 141. DOI:10.1016/j.talanta.2007.10.043
[3]	陈顺保, 徐美香, 黄德馨, 等. 多种维生素注射液的研究和临床应用[J]. 上海医药, 2014(2): 36. CHEN SB, XU MX, HUANG DX, et al. Vitamins research and clinical application of injection[J]. Shanghai Pharm, 2014(2): 36.
[4]	TAYADE AB, DHAR P, KUMAR J, et al. Sequential determination of fat-vitamins and water-vitamins in Rhodiola imbricaba root from trans-hymalaya with rapid resolution liquid chromat-ography/tandem mass spectrometry[J]. Anal Chim Acta, 2013, 789(5): 65.
[5]	HAMRAPURKAR P, PHALE M, PATIL P, et al. Reversed-phase high performance liquid chromatography method with coul-ometric eletrichemical and ultravoilet detection for the quantification of vitamin B₁(thiamine), B₆(pyridoxamine pyridoxal and pyridoxine), B₁₂ in animal and plant foods[J]. J Chromatogr A, 2007, 1173(1-2): 71. DOI:10.1016/j.chroma.2007.09.072
[6]	PHILLIPS M. Liquid chromatography with isotope-dilution mass spectrometry for determination of water-soluble vitamins in foods[J]. Anal Bioanal Chem, 2015, 407(11): 2965. DOI:10.1007/s00216-014-8354-y
[7]	王希希, 胡燕, 孙轶卓, 等. 反相高效液相色谱法同时测定血清中5种水溶性维生素[J]. 四川大学学报, 2010, 41(1): 158. WANG XX, HU Y, SUN YZ, et al. Simultaneous determination of 5 kinds of vitamins in serum[J]. J Sichuan Univ, 2010, 41(1): 158.
[8]	CIULU M, SOLINAS S, FLORIS I. Determination of water-soluble vitamins in honey[J]. Talanta, 2011, 3(83): 924.
[9]	KARACA I. Simultaneous determination of water and fat-soluble vitamins in pekmez samples by high performance liquid chromatography couple with diode array detection[J]. Asian J Chem, 2010, 5(22): 4083.
[10]	宋萍萍, 曹江平, 刘书慧. 反相高效液相色谱法测定果醋中的8种维生素[J]. 食品科学, 2012, 23(12): 181. SONG PP, CAO JP, LIU SH. Determination of 8 kinds of vitamins in vinegar by RP-HPLC[J]. Food Sci, 2012, 23(12): 181.
[11]	周有祥, 赵明明, 彭茂民. 水溶性维生素检测分析研究进展[J]. 湖北农业科学, 2013, 23(52): 5676. ZHOU YX, ZHAO MM, PENG MM. Research progress on detection and analysis of water soluble vitamins[J]. Hubei Agric Sci, 2013, 23(52): 5676.
[12]	REN DD, XIE YF, LIU JJ. Simultaneous determination of nine water-soluble vitamins in foods by high performance liquid chromatography[J]. J Food Saf Qual, 2014, 5(3): 657.
[13]	MORENO P, SALVAO V. Simultaneous determination of twelve water and fat-soluble vitamins by high-performance liquid chromatography with diode array detection[J]. Chromatographia, 2001, 54(31): 270.
[14]	LIANG Y, HE K, HE Y. Simultaneous determination of six water-soluble vitamins in feed by ultra-high performance liquid chromatography-tandem spectrometry[J]. Feed Ind, 2016, 17(2): 324.
[15]	张慧, 裴志东, 初正云, 等. HPLC测定注射用脂溶性维生素中4种成分的含量[J]. 中国现代应用药学, 2009, 13(6): 480. ZHANG H, PEI ZD, CHU ZY, et al. Determination of contents of 4 kinds of fat-soluble components for injection by HPLC[J]. Chin J Mod Appl Pharm, 2009, 13(6): 480.
[16]	ZAFRAGOME A, GARBALLO A, MORALES JC, et al. Simultaneous determination of eight water-soluble vitamins in supplemented foods by liquid chromatography[J]. J Agric Food Chem, 2006, 54(13): 4531. DOI:10.1021/jf060346e
[17]	蒋晔. 反相高效液相色谱法同时测定9种水溶性维生素[J]. 药物分析杂志, 2005, 25(3): 339. JIANG Y. RP-HPLC simultaneous determination of 9 kinds of water-soluble vitamins[J]. Chin J Pharm Anal, 2005, 25(3): 339.
[18]	PHINNEY KW, RIMMER CA, THOMAS JB. Isotope dilution liquid chromatography-mass spectrometry methods for fat-and water-soluble vitamins in nutritional formulations[J]. Anal Chem, 2011, 83(1): 92. DOI:10.1021/ac101950r
[19]	WANG X, WANG S, CAI Z. The lastest developments and applications of mass spectrometry in food-safety and quality analysis[J]. Trac Trends Anal Chem, 2013, 52(8): 170.
[20]	周围, 刘倩倩, 王波, 等. 高效液相色谱法同时测定婴幼儿乳粉中7种水溶性维生素[J]. 分析试验室, 2015, 34(1): 49. ZHOU W, LIU QQ, WANG B, et al. RP-HPLC simultaneous determination of 7 kinds of water-soluble vitamins in infant formula[J]. Chin J Anal Lab, 2015, 34(1): 49.
[21]	RODAS MB, MORERA PS, CASTELLOTEAI, et al. Rapid determination by reversed-phase high-performance liquid chromatography of vitamins A and E in infant formulas[J]. J Chromatogr A, 2003, 18(10): 197.
[22]	PAPADOYANNIS IN, TSIONI GK, SAMANIDU VF. Simultaneous determination of nine water and fat soluble vitamins after SPE separation and RP-HPLC analysis in pharmaceutical preparations and biological fluids[J]. J Liq Chromatogr Relat Technol, 2006, 20(19): 3203.