神农丸是山东省肿瘤医院医院制剂(鲁药制字ZBZ0034)，已在临床上使用多年，具有通络散结、消肿定痛之功，用于胃癌、胃炎、胃溃疡等疾病的治疗，疗效确切，深得临床医生和患者的好评。本品是由制马钱子、薏苡仁、甘草3种药味经粉碎制成的糊丸。制马钱子为方中君药，士的宁与马钱子碱为其主要的药效成分，但也是主要的毒性成分，特别是士的宁的毒性较大，安全范围窄。原质量标准采用紫外分光光度法控制其含量，专属性较差，准确度低，难以满足目前对药物安全性控制的要求。本文采用氨基键合硅胶为填料的色谱柱，应用HPLC法对本品中的士的宁与马钱子碱进行了含量测定。流动相无需加入离子对试剂，操作简便，色谱图基线稳定，色谱峰对称、分离度好，方法学研究结果表明，本方法重复性好，准确度高，可作为神农丸中士的宁与马钱子碱的含量测定方法。现报告如下。

1 材料 1.1 仪器

1260 infinity高效液相色谱仪，包括G1329B型自动进样器、G1315C型DAD紫外检测器、Open LAB工作站(美国Agilent公司)；色谱柱(氨基键合硅胶柱，ZORBAX NH₂，4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Agilent公司)；十万分之一电子天平(AUW220D，日本Shimadzu)。

1.2 药品与试剂

神农丸(每丸重约0.16 g，山东省肿瘤医院医院制剂，鲁药制字ZBZ0034)；乙腈(色谱纯，美国ACS)；异丙醇(色谱纯，科密欧试剂公司)，士的宁对照品(供含量测定用，纯度≥98%，批号：150928，嘉世玉禾化工技术研究院)；马钱子碱对照品(供含量测定用，纯度≥98%，批号：150619，嘉世玉禾化工技术研究院)。其他所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

以(ZORBAX NH₂，4.6 mm×250 mm，5 μm，Agilent)为色谱柱；以乙腈-异丙醇-3%磷酸溶液(80:10:10)为流动相；检测波长为260 nm；柱温：40 ℃；流速：1.0 mL∙min^-1；进样量：5~10μL。

2.2 溶液的制备 2.2.1 供试品溶液

取本品适量，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氢氧化钠试液5 mL，混匀，放置30 min，精密加入三氯甲烷20 mL，密塞，称量，置水浴中回流提取2 h放冷，再称量，用三氯甲烷补足减失的量，摇匀，分取三氯甲烷液，滤过，精密量取续滤液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 对照品溶液

精密称取士的宁对照品2.56 mg，马钱子碱对照品2.88 mg，置同一10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品储备液；精密量取上述对照品储备液1 mL，加甲醇稀释成每1 mL分别含士的宁25.6 μg，含马钱子碱28.8 μg的溶液，即得。

2.2.3 缺制马钱子阴性对照溶液

照处方比例称取除制马钱子外的其他各味，按照样品的制备工艺制得缺制马钱子阴性样品，取该阴性样品，照供试品溶液的制备方法制得缺制马钱子阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

分别精密吸取“2.2”项下的对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，并记录色谱图，结果士的宁与马钱子碱峰形对称，与前后峰的分离度达1.5以上，理论板数分别达到17 178和13 406。且阴性对照色谱在与对照品色谱相应的保留时间范围内无吸收峰干扰。色谱图见图 1。

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下的士的宁与马钱子碱混合对照品溶液2、4、6、8、10、15、20 μL，注入高效液相色谱仪，依法测定峰面积。分别以对照品的进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)进行线性回归，结果士的宁、马钱子碱进样量分别在0.051 2~0.512 μg、0.057 6~0.576 μg范围内线性关系良好，回归方程：

Y=1 989.6X+3.610  r= 0.999 9

Y=1 932.8X-2.569  r=1.000

2.5 精密度考察

精密吸取“2.2”项下的士的宁与马钱子碱混合对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，依法测定峰面积，结果士的宁峰面积积分值的RSD为0.25%；马钱子碱峰面积积分值的RSD为0.21%。表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性考察

精密吸取“2.2”项下新制备的供试品溶液10 μL，分别在0、2、4、6、8、24 h时注入液相色谱仪，依法测定，结果供试品士的宁峰面积积分值的RSD为0.18%；马钱子碱峰面积积分值的RSD为0.33%。表明供试品溶液制备后，在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批(20160911)样品6份，照“2.2”项下方法制得供试品溶液，依法测定士的宁与马钱子碱的含量，结果士的宁的平均含量为7.121 mg∙g^-1，其RSD为1.5%；马钱子碱的平均含量为4.162 mg∙g^-1，其RSD为1.4%。表明本方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取同一批(20160911)样品0.5 g，精密称定，共取6份，分别加入氢氧化钠试验5 mL，混匀，放置30 min，先精密加入用三氯甲烷配制好的混合对照品溶液(每1 mL含士的宁2.470 mg，马钱子碱2.554 mg)1 mL，余按供试品溶液的制备方法制得回收率试验供试溶液。依法测定士的宁与马钱子碱的含量，并计算回收率。结果士的宁的平均回收率为98.6%，RSD为1.2%；马钱子碱的平均回收率为96.7%，RSD为0.30%。表明本品士的宁与马钱子碱的测定方法准确度高。结果见表 1。

2.9 样品的含量测定

分别精密吸取对照品溶液与神农丸样品的供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，依法测定，计算各批样品中士的宁与马钱子碱的含量。结果见表 2。

3 讨论 3.1 士的宁与马钱子碱含量测定方法变迁

士的宁与马钱子碱的含量测定方法，20世纪90年代基本以紫外分光光度法和双波长扫描法为主^[1-4]，并有了应用高效液相色谱法进行士的宁含量测定的报道^[5-7]。徐丽华等^[8]应用色谱柱Platinum silica(All-tech 3 μm，4.6 mm×150 mm)，流动相：正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨试液(47.5:47.5:5:0.35)，检测波长：254 nm，同时测定士的宁与马钱子碱2种成分含量，得到了较满意的结果；2000年版中国药典一部马钱子项下含量测定正是采用其方法^[9]。金红宇等^[10]发表以十八烷基硅合硅胶为固定相，以磷酸缓冲盐加入离子对试剂为流动相的HPLC测定方法，2005年版及以后的中国药典马钱子含量测定均采纳了其方法^[11]。近些年的文献报道中，以十八烷基硅合硅胶为固定相，流动相有采用乙腈加磷酸缓冲盐的^[12]，也有乙腈加冰醋酸三乙胺缓冲水溶液的^[13]，但大多数还是沿用了现行版中国药典中的色谱条件^[14-21]。

3.2 色谱条件优选

经试验，现行版药典马钱子含量测定色谱条件中，离子对试剂配制方法复杂、要求高，难以得到稳定平直的基线，成分峰的峰形常有前后拖尾现象，分离度较差(图 1-A)。本文以氨基键合硅胶为固定相，以乙腈-异丙醇-3%磷酸溶液(80:10:10)为流动相，得到了基线稳定、主成分峰峰形对称、分离度高的色谱图，此色谱条件用于士的宁与马钱子碱的含量测定尚未见报道。在后续生物碱含量测定方法研究中，我们将进一步扩展氨基色谱柱适用范围，以期为生物碱的含量测定提供更佳的方法。

3.3 供试品制备方法优选

本品供试品溶液的制备方法是参考现行版药典马钱子药材含量测定项下供试品溶液的制备方法并经实验改进所得。实际操作中，本品按1 g取样量，曾对氢氧化钠试液的加入量进行了考察。设计了3、4、5、6 mL 4个不同的用量，以士的宁与马钱子碱的含量为指标进行考察，结果表明以加入5 mL氢氧化钠试液制得的供试品测得的含量较高，再增加用量含量不再增加。故确定氢氧化钠试液的用量为5 mL。

综上所述，本文报道的士的宁与马钱子碱的含量测定方法操作简便，重复性好，准确度高，可用于神农丸中士的宁与马钱子碱的含量测定，也为下一版中国药典马钱子中士的宁与马钱子碱含量测定方法的改进提供参考。