2018, Vol. 38 
2. 成都中医药大学基础医学院, 成都 610072
2. Basic Medical College, Chengdu University of TCM, Chengdu 610072, China
萘敏维滴眼液用于缓解眼睛疲劳、结膜充血以及眼睛发痒等症状，是含盐酸萘甲唑林(C14H14N2·HCl)、马来酸氯苯那敏(C16H19ClN2·C4H4O4)和维生素B12(C63H88CoN14O14P)的复方眼药水，英文名为naphazoline hydrochloride，chlorphenamine maleate and vitamin B12 eye drops，缩写为NCVE)[1]。按照中国药典2015年版制剂通则规定[1]，眼用制剂应符合无菌要求。由于多剂量包装的滴眼液打开后反复使用存在微生物污染的可能[2]，因此，生产厂家通常会加入抑菌剂来抑制微生物的生长，以保证用药安全。萘敏维滴眼液常见使用的抑菌剂有苯扎溴铵[3]、羟苯乙酯[4]和三氯叔丁醇[5]等。但是，药品中加入的抑菌剂是否能有效抑制外来微生物的生长，这在一般的药品质量标准中未能体现。如果抑菌剂添加量不足，会增加微生物污染的风险[6]，如果添加量过多，会产生眼表毒性[7]。此外，抑菌剂使用量是否合理，需在具体品种处方中进行测定才有实际意义[8]。由于萘敏维滴眼液是常用药，且使用广泛，因此，对抑菌剂抑菌效力和合理添加量的研究显得十分重要。本试验根据中国药典2015年版“抑菌效力检查法”中的相关规定，对含上述抑菌剂的12个厂家14批萘敏维滴眼液进行了抑菌效力测定，并对抑菌剂的最适抑菌浓度进行了考察。
1 仪器与材料 1.1 仪器生物安全柜(BHC-1 000ΙΙA/B3，苏净集团安泰公司)；三用恒温水箱(DK-600S型，上海精宏实验设备有限公司)；数显恒温培养箱(LRH-250)；高压灭菌锅(HVA-110，HIRAYAMA)；微量移液枪(ECOPIPETTE，0~200 μL)；一次性无菌刻度吸管(1 mL，10 mL)；一次性无菌培养皿；试管等。
1.2 试验菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]、大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]，均由中国食品药品检定研究院提供。
1.3 培养基胰酪大豆胨琼脂培养基(批号：150916)、胰酪大豆胨液体培养基(批号：140113)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号：150815)、沙氏葡萄糖液体培养基(批号：150914)，均由北京三药科技有限公司提供。
1.4 试药氯化钠(批号：20150823，天津科密欧试剂有限公司)；苯扎溴铵(批号：20150617，成都西亚化工股分有限公司)、羟苯乙酯(批号：20160426，天津市科密欧化学试剂开发中心)、三氯叔丁醇(批号：20150319，国药集团化学试剂有限公司)；盐酸萘甲唑啉(批号：140501)、马来酸氯苯那敏(批号：140901)、维生素B12(批号：141001)、玻璃酸钠(批号：2014090302)和依地酸二钠(批号：102320140701)由沈阳兴齐眼药股份有限公司提供。
1.5 样品样品的选取主要考虑2个方面，一是添加的抑菌剂具有代表性；二是尽量覆盖不同厂家。本试验选取添加苯扎溴铵的样品作为阳离子表面活性剂类抑菌剂的代表，选取添加羟苯乙酯的样品作为酯类抑菌剂的代表，选取添加三氯叔丁醇的样品作为醇类抑菌剂的代表[9]。本实验抽取样品共14批次，涉及12家生产企业，12个批准文号，4种规格，其中生产单位抽样3批，经营单位抽样8批，市场抽样3批。最终得到含苯扎溴铵的共10个厂家10批样品(规格7~15 mL)，含羟苯乙酯的1个厂家2批样品(规格10 mL)和三氯叔丁醇1个厂家2批样品(规格1 mL×10支)，每批样品抽样数量均为20份。萘敏维滴眼液配方主药是盐酸萘甲唑啉、马来酸氯苯那敏和维生素B12，辅料各厂家略有不同，一般为依地酸二钠、玻璃酸钠和氯化钠等。
2 方法与结果 2.1 抑菌剂含量测定采用高效液相色谱。参照中国药典2015年版阿昔洛韦滴眼液【检查】项下测定。样品信息和测定结果见表 1。
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表 1 试验样品情况 Table 1 Test samples |
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释。取黑曲霉的新鲜培养物加入0.9%无菌氯化钠溶液3~5 mL，将孢子洗脱，并用适量0.9%无菌氯化钠溶液稀释。各试验菌制成接种菌液，每1 mL含菌数(孢子数)约为107~108 CFU，并采用梯度稀释进行计数。
2.3 供试品接种规格大于7 mL的样品，每个厂家取包装完整的样品10份，分别采用无菌操作打开内盖，直接用移液枪接种5种试验菌液(10 μL·mL-1)，使每1 mL样品中菌量(孢子)约为105~106 CFU，每种试验菌接种2份。规格为1 mL的样品，分别取样转移至5支无菌试管中，每支试管装15 mL，试验菌接种方法同上。接种完成后，置25 ℃培养箱中避光贮存。
2.4 抑菌效力测定细菌计数采用胰酪大豆胨琼脂培养基，真菌计数采用沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养基在使用前按照药典方法进行适用性检查[1]，符合药典要求。接种试验菌后，在第6、24 h，以后在第7、14、28 d取样，测定每1 mL供试品中细菌数；在第7、14、28 d取样测定每1 mL供试品中真菌数。计数时分别从接种不同试验菌的供试品中取样1 mL，采用梯度稀释法测定。根据存活菌数测定结果来计算各间隔时间菌数lg值与1 mL供试品中接种的菌数lg值的相差值，按照表 3标准进行判断。部分样品测定结果见表 2。
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表 2 抑菌效力测定结果(中国药典2015年版) Table 2 Results of antimicrobial effectiveness testing(ChP 2015) |
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表 3 眼用制剂抑菌效力判断标准(中国药典2015年版) Table 3 Criterion of inhibitory effectiveness for ophthalmic preparations(ChP 2015) |
中国药典2015年版对眼用制剂抑菌效力的规定为：一般要求达到A级，特殊情况下至少达到B级。抑菌效力达到某级是指5种试验菌的抑菌效力均达到该级，从表 2来看，苯扎溴铵含量最高和最低的2个厂家(邯郸康业和安徽艾珂尔)样品对细菌和真菌的抑菌效力均能达到A级，其余8个厂家的样品抑菌效力均达到A级(表中未列出)；添加羟苯乙酯的江苏远恒2批样品对黑曲霉能达到A级，对其余4种试验菌能达到B级，因此总体为B级；添加三氯叔丁醇的沈阳兴齐2批样品对细菌的抑菌效力能达到B级，对真菌的抑菌效力达不到B级，总体 < B级。对照表 3抑菌效力标准来看，含苯扎溴铵的样品菌量减少的lg值远高于标准规定值，说明可能存在添加过量的情况，而含三氯叔丁醇的样品则可能存在添加不足的情况。
2.5 抑菌剂最适抑菌浓度考察 2.5.1 空白对照接种为了解试验菌在不含抑菌剂的配方中的生长情况，制备了空白对照。按厂家提供的配方，称取盐酸萘甲唑啉0.03 g，马来酸氯苯那敏0.3 g，维生素B12 0.5 g，以及适量辅料，加1.5 L灭菌水溶解并混匀，调节pH至4.7，后通过0.22 μm滤膜过滤除菌，取适量滤液分装至无菌试管中，每管15 mL，按供试品接种方法接种试验菌，25 ℃避光贮存，测定时间和结果计算方法同样品抑菌效力测定。
2.5.2 最适浓度考察按空白对照制备方法，配制溶液，过滤除菌后，滤液分装至无菌试管中，每管15 mL。试验设置3种抑菌剂处理，每种处理设置5个浓度梯度，分别是：苯扎溴铵0.005、0.01、0.03、0.05、0.08 mg·mL-1；羟苯乙酯0.3、0.6、0.8、1.0、1.2 mg·mL-1；三氯叔丁醇2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg·mL-1。按供试品方法接种试验菌，25 ℃避光贮存，测定时间和结果计算方法同样品抑菌效力测定。
从表 4可以看出，在未添加抑菌剂的空白对照中，各时间点测定的抑菌效力均达不到B级要求，其中白色念珠菌和黑曲霉在一定时间内还有增加趋势。从抑菌剂最适抑菌浓度来看，苯扎溴铵的浓度在0.01 mg·mL-1时，抑菌效力能达到B级，在0.03 mg·mL-1时，抑菌效力能达到A级，说明0.01~0.03 mg·mL-1是上述2种抑菌剂能满足药典要求的抑菌浓度，同样羟苯乙酯的最适抑菌深度是0.6~0.8 mg·mL-1，而三氯叔丁醇的最适抑菌浓度是6.0~8.0 mg·mL-1。
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表 4 抑菌剂最适剂量筛选结果 Table 4 The result of optimum inhibitive concentration for Bacteriostats |
苯扎溴铵属于含阳离子表面活性剂类抑菌剂，在萘敏维滴眼液中被广泛使用，本次调查中占到厂家总数的83%，10批样品实测含量在0.024~0.156 mg·mL-1之间，与标示量有一定差异，实测最高与最低相差6.5倍，即便是最低含量的样品，抑菌效力测定也表明，接种细菌6 h后菌数已降至0，接种真菌7 d后菌数已降至0，细菌和真菌数量下降的lg值均远高于A级标准2 lg。最适抑菌浓度考察表明，苯扎溴铵的浓度在0.01~0.03 mg·mL-1时，抑菌效力介于A级和B级之间，符合药典要求。若参照最适浓度，10批测定样品有80%过量添加，且添加量是A级标准的2.6~ 5.2倍，是B级标准的7.7~15.6倍。季铵盐类抑菌剂是目前应用广泛的眼用制剂抑菌剂，其安全性和有效性得到认可，据报道常用浓度为0.04~0.2 mg·mL-1[10]，但是，合理的抑菌剂含量应该是最低有效含量。建议厂家对苯扎溴铵用量进行优化。
3.2 含羟苯乙酯样品的抑菌效力符合B级要求羟苯乙酯属于酯类抑菌剂，在萘敏维滴眼液中使用较少，本次只抽到一个厂家，仅占调查厂家的8.3%，2批样品实际含量与标示含量一致，为0.6 mg·mL-1。抑菌效力测定表明，对黑曲霉能达到A级，对其余试验菌能达到B级，总体符合抑菌效力B级要求，这与最适抑菌浓度筛选试验结果一致。当羟苯乙酯的浓度为0.8 mg·mL-1时，对试验菌均能达到A级效力，因此0.6~0.8 mg·mL-1是该抑菌剂的最适浓度范围。由于羟苯乙酯在水中溶解度极低，《中国医院制剂规范》指出羟苯乙酯的抑菌浓度为0.02%~0.08%(即0.2~0.8 mg·mL-1)[11]，本研究的最适抑菌浓度符合上述要求。
3.3 含三氯叔丁醇样品的抑菌效力较差，应对其适用性作进一步探讨三氯叔丁醇属于醇类抑菌剂，本次只抽到一个厂家，占调查厂家的8.3%。样品的标示量为3.0 mg·mL-1，2批样品实测含量不到60%，标示量与实测量有较大差异。抑菌效力测定表明，对细菌的抑菌效力能达到B级，但对真菌几乎没有抑制作用，与不添加抑菌剂的处理相一致，达不到B级。从最适抑菌浓度筛选试验来看，在6.0~8.0mg·mL-1时，抑菌效力介于A级和B级之间，符合药典要求。若参照最适浓度，2批样品的添加量仅为A级标准的21.9%，B级标准的29.2%。有文献报道，三氯叔丁醇在pH高于5.0时不稳定，抑菌活性也会降低[12]。而萘敏维滴眼液的标准规定pH为4.5~6.0，所以，如果选三氯叔丁醇为抑菌剂，则对滴眼液的pH应严格加以控制，如果pH高于5.5，建议不用。此外，三氯叔丁醇眼用可引起眼部刺激。梁光江[13]报道其浓度在0.5%(5 mg·mL-1)时单次给药对兔眼无刺激性，长期使用时具有轻度刺激性。此外，已有报道滴眼液中抑菌剂联合使用可以达到减量增效的作用[14]。因此，建议对其适用性作进一步探讨，添加时也不建议单一使用，可考虑与其他抑菌剂一起复合使用，以降低安全风险。
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