Sabin株脊髓灰质炎减毒活疫苗（oral poliovirus vaccine，OPV）在我国消灭脊灰运动中发挥了巨大的作用。在疫苗生产过程中，尤其是病毒的增殖过程中，部分病毒发生突变，可导致其神经毒力升高，因此在疫苗的质控中，采用猴体神经毒力试验检测疫苗原液，以控制其神经毒力。但由于猴子来源困难，价格昂贵，技术操作也有一定难度，人们期望建立其他方法来代替，或者减少猴子的使用数量。通过对疫苗株及神经毒力回复株的序列比较，人们注意到基因组5′UTR非编码区域特定位点的改变，例如在Ⅲ型中472－U突变为C，Ⅰ型中525－T变为C，Ⅱ型中481－C变为G等与毒力的恢复密切相关，少量病毒发生突变即可影响其毒力。例如，Ⅲ型中472－C突变超过1%的疫苗批次即无法通过猴体神经毒力试验^[1]。

基于以上研究，Chumakov等^[2-3]于1980年代建立了MAPREC（mutant analysis by PCR and restriction enzyme cleavage）方法，对疫苗原液中涵盖突变位点的片段进行扩增并标记同位素，然后以特定内切酶进行切割，则涵盖突位点的片段可被切割成小片段，以电泳方法分离，对突变进行定量检测。经过国际协作研究，WHO将其列入OPV疫苗规程，作为猴体神经毒力试验前的预筛手段，规定Ⅲ型原液中472－C比例不得高于1% ^[4]。

鉴于突变靶位含量较低，传统的MAPREC操作中需要同位素标记来进行检测，这虽然增加了方法的敏感性和准确性，但也限制了其广泛应用。本研究在WHO的MAPREC标准操作规程的基础上^[5]，使用荧光标记代替同位素标记，建立了荧光MAPREC法来分析Ⅲ型Sabin株脊髓灰质病毒突变含量。现报道如下。

1 材料与方法 1.1 标准品和样品

MAPREC国际标准品均购自英国国家生物制品检定所（NIBSC）。100% DNA（编号94/790）标准品为100% 472-C的合成单链DNA片段，用以评价实验的酶切效率，单次实验酶切效率不应低于90%。International Standard DNA（IS DNA，编号95/542）标准品为含有0.9% 472-C的合成单链DNA片段，用以模拟接近合格上限的样品。Low Mutant Virus Reference（LMVR，编号96/572）为含有0.7% 472-C的Ⅲ型Sabin株病毒，用以模拟合格的样品。High Mutant Virus Reference（HMVR，编号96/578）为含有1.1% 472-C的Ⅲ型Sabin株病毒，用以模拟不合格的样品。实验用的疫苗生产毒种，单次收获液和疫苗原液均来自北京天坛生物制品有限公司。

1.2 主要试剂与仪器

病毒RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit货号52904为QIAGEN公司产品。反转录试剂盒ThermoScript RT-PCR System货号11146-032为Invitrogen公司产品。PCR酶AmpliTaq Gold 360 Master Mix货号4398881为ABI公司产品。DNA内切酶MboⅠ货号R0147L为NEB公司产品。PCR仪DNAEngine PTC-200为伯乐公司产品。电泳槽Hoefer SE 600，激光扫描仪Typhon 9500均为GE公司产品。PCR引物及荧光引物均为Invitrogen公司合成并使用HPLC方式进行纯化，见表 1。

1.3 引物荧光标记物的选择

将不同荧光标记的引物使用TE缓冲液系列稀释为不同浓度，之后与1/3体积的30%甘油混合，取5 μL上样于10%聚丙烯酰胺P凝胶，TBE缓冲液进行电泳，上样量为12.5 ng至1 pg。500 V电泳30 min后，使用激光扫描仪Typhon 9500进行扫描，获取图像。使用Quantity One软件分析条带的荧光信号强度，并对信号强度与引物浓度进行线性回归后计算R²。选取不同稀释度间线性关系良好、灵敏度高的标记物进行进一步实验。

1.4 RNA提取与反转录

将国际标准品LMVR与HMVR按照试剂盒说明书进行RNA提取后，按照反转录试剂盒ThermoScript RT-PCR System说明进行cDNA合成，反应条件，25 ℃反应10 min后，50 ℃反应40 min。反转录所得cDNA可以立即使用或在-20 ℃条件下保存1个月。

1.5 cDNA使用浓度的优化

分别吸取360 Master Mix 875 μL，pS-3 175 μL（30 μg·mL^-1），pA-3 175 μL（3 μg·mL^-1），去离子水350 μL混合后作为PCR Mix。PCR反应体系的配制：取cDNA 6.25 μL与56.25 μL PCR Mix混合，之后取12.5 μL至50 μL PCR Mix中进行5倍稀释，共做7个稀释度。按照以下条件进行PCR反应：94 ℃ 10 min后，进行40个循环扩增，94 ℃30 s，55 ℃15 s，68 ℃ 1 min。以生成单链DNA扩增产物。取10 μL扩增产物，加入1 μL 360 Master Mix和1 μL 6 μg·mL^-1的pA-3/CY5标记引物，混匀离心后72 ℃反应10 min，进行PCR产物的荧光标记。取6 μL标记产物加入2 μL 30%甘油，按照“1.2”项所述条件进行电泳和扫描分析。选取无剩余引物条带，并且进行125倍稀释后仍有PCR产物条带的cDNA浓度作为适宜浓度。

1.6 突变率的检测

100% DNA与IS DNA标准品均使用100 μL去离子水复溶。吸取两DNA标准品与稀释至适宜浓度的LMVR与HMVR cDNA各5 μL，分别与45 μL的PCR Mix混合，按照“1.4”项条件进行PCR反应和荧光标记。吸取6 μL标记后的产物，加入1 μL 2 U·μL-1 DNA内切酶MboⅠ，37 ℃孵育2 h。将进行及未进行酶切的荧光标记产物进行电泳和扫描分析，按照图 1所示分析突变比例。样品的突变率检测同LMVR与HMVR标准品。

2 结果 2.1 不同荧光标记引物的检测限

将表 1中使用不同荧光标记的引物系列稀释后直接进行电泳分析。结果如表 2所示：不同荧光标记的引物检测限差异很大，其中pA-3/CY5最为灵敏，检测限达到5 pg，而pA-3/Rhodamine Green最不灵敏，检测限为500 pg。引物浓度对荧光强度进行线性回归后计算R²值，除pA-3/FAM外，R²值均大于0.98，线性良好。因此，选取最为灵敏的pA-3/CY5引物作为实验中使用的荧光标记引物。

2.2 cDNA使用浓度的优化及突变率检测

对cDNA进行5倍系列稀释作为模板进行扩增，电泳结果如图 2所示，5⁰至5³稀释时扩增产物明显，且均无明显剩余引物，对后续试验干扰较小，本研究选择稀释5¹倍浓度进行后续研究。

2.3 国际标准品突变率检测

采用建立方法，对4个国际标准品进行检测。如图 3所示，将扩增产物进行酶切后，均能够清楚分离酶切和未酶切条带，突变率计算结果见表 3。4个国际标准品的472-C突变检测值与其标示值基本一致，说明方法的准确性良好。并且，除LMVR标准品不同实验间RSD为10.0%外，其余标准品的RSD均小于10%。说明方法的精密度良好。100% DNA control标准品检测突变率为95.59%，主要是因为酶切效率难以达到100%，符合WHO SOP中该标准品酶切效率不应低于90%的要求^[5]。

2.4 不同批次样品中突变率检测

对Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎减毒活疫苗生产用的工作种子、疫苗原液和单次收获液进行检测，结果见表 4。所有样品均满足WHO关于突变率小于1%的要求。其中疫苗生产的工作种子突变率最低，为0.64%，经过传代的单次收获液和疫苗原液突变率略有升高，但均低于1%。并且不同的单次收获液和疫苗原液中突变率在0.76%~0.90%之间，较为稳定。

3 讨论

传统的MAPREC法采用同位素标记增加检测的灵敏度，以准确检测含量甚微的突变成分。而使用EtBr染色的方法仅能够检测到10%以上的突变^[6]。SYBR Green-I染色的方法检测DNA具有高灵敏度低背景的特点^[7-8]，使用该染色方法能够检测到低至0.3%~0.4%的突变^[9]。有学者建立了荧光定量PCR对突变进行检测的方法，以检测粪便和污水样品中病毒毒力回复的情况^[10-11]，相比传统的MAPREC方法快速简便，但灵敏度仍然较低。飞行时间质谱^[12]和基因芯片^[13-14]对突变率进行检测具有较高的灵敏度，但繁重的操作量和高昂的实验成本限制了其广泛应用。

本研究采用高灵敏度的荧光标记物代替同位素标记，建立了荧光MAPREC方法。通过对多个不同的荧光标记物进行筛选，发现CY5标记的荧光引物最为灵敏，检测限到低至5 pg。并且，引物量从12.5 ng到5 pg时与荧光信号强度间线性关系良好，R²值大于0.99。之后，以CY5标记引物代替同位素标记引物，成功建立了检测Ⅲ型Sabin株472 -C突变含量的荧光MAPREC方法，并以国际标准品对方法进行了验证。结果显示，4个国际标准品的检测值均与其标示值基本一致，并且，不同实验间RSD小于15%，说明所建立的方法较为稳定。采用建立的方法，对多个批次的OPV正常生产的工作种子，疫苗原液和单次收获液进行了检测，结果显示，所有样品的突变率均满足WHO的要求，与这些批次的猴体神经毒力试验结果一致。

除OPV疫苗外，WHO对Sabin株灭活疫苗也增加了MAPREC方法的要求^[15]。但MAPREC方法本身操作较为复杂，加之采用同位素标记，因此，虽然该方法列入WHO规程，但仅有极少数国家能够开展此项检测。本研究建立的方法中采用荧光标记法，可以代替同位素法进行病毒突变比例的检测，从而消除了该方法推广的最大障碍，对该疫苗的质控有重要的意义。