小大黄系民族地区常用药材，藏药名为曲玛孜，为蓼科植物小大黄Rheum pumilum Maxim.的干燥根和根茎，生长在海拔3 600~4 300 m的林下，稀疏灌木丛林地、林缘、湿润草滩，产于青藏高原，具有清胃肠积热，泻下的作用，藏医常用于便秘、腹水、黄水病、腹痛、瘀血等症。

藏医文献所记载的大黄种类远比中药大黄的原植物多，藏医根据大黄药材药性的强烈、温和、逊次将其分为上、中、下三品，下品即曲玛孜^[1-3]。文献研究表明曲玛孜藏药品种来源应该为蓼科大黄属的一类植物，它们是塔黄、小大黄、水黄、头序大黄、白小黄等植物^[4]，西藏部分地区用的是塔黄，青海部分地区用的是小大黄^[5]。目前对小大黄生药研究比较少，缺乏有效质量控制方法。本文在参考大黄属植物成分研究和含量测定^[6-14]的基础上，研究建立了小大黄药材的显微鉴别和薄层色谱鉴别；采用高效液相色谱法测定了大黄素、大黄酚的含量，增订了其检查和浸出物项。研究所建立的定性定量方法提取方便，处理简单，可为小大黄的质量控制提供参考。

1 材料与试药

LC-20A高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器（岛津公司）；Milli-Q advantage A10超纯水仪（密理博公司）AuW220D型万分之一电子天平（岛津公司）；CP225D型十万分之一电子天平（赛多利斯公司）；BX51型照相显微镜（奥林巴斯公司）；KQ5200B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）。

小大黄药材从青海海东、互助各地采集，共计6批，经青海省药品检验检测院主任药师骆桂法鉴定为小大黄Rheum pumilum Maxim.的根；对照品大黄素（批号10756-200110）、大黄酚（批号110796-201017，纯度99.6%）、大黄素甲醚（批号110758-200509，纯度95.6%）及对照药材唐古特大黄（批号120911-201110）购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果 2.1 显微鉴别

小大黄粉末为黄色至黄棕色。草酸钙簇晶众多，直径约17~60 μm，顶端较钝（图 1-A）；导管多为网纹导管、螺纹导管（图 1-B）；淀粉粒多为单粒，类球形，半圆形，类三角形，脐点点状或短缝状，不甚明显（图 1-C）。

2.2 TLC鉴别

分别取小大黄、唐古特大黄药材粉末约0.2 g，加甲醇20 mL，浸泡h，滤过，取滤液5 mL，蒸干，残渣加水10 mL使溶解，再加36%盐酸1 mL，加热回流30 min，立即冷却，用乙醚分2次振摇提取，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取小大黄对照药材，同法制成对照药材溶液。再分别取大黄素、大黄素甲醚、大黄酚的对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。吸取上述溶液各3 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（30~60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15:5:1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，小大黄样品在与小大黄对照药材色谱相应的位置上，显相同的3个橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点。而唐古特大黄药材在该薄层色谱中显5个橙黄色荧光斑点，TLC图见图 2。

2.3 检查

为全面控制小大黄药材质量，依据中国药典2015年版四部各项测定法对其水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物检查项进行了考察，结果见表 1；并根据6批样品的测定结果制定了限度。暂定水分不得过12.0%，总灰分不得过15.0%，酸不溶性灰分不得过2.0%。醇溶性浸出物（95%乙醇作溶剂）不得少于13.0%。

2.4 含量测定 2.4.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：SunFire-C₁₈色谱柱（十八烷基硅烷键合硅胶，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（85:15）；流速：1.0 mL·min^-1；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃。理论板数按大黄素峰计算不低于3 000。色谱图见图 3。

2.4.2 混合对照品溶液的制备

精密称取大黄素对照品适量，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为0.144 0 mg·mL^-1的大黄素储备液；精密称取大黄酚对照品适量，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为0.154 8 mg·mL^-1的大黄酚储备液。精密量取上述大黄素储备液5.0 mL及大黄酚储备液10.0 mL，置同一25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液（大黄素质量浓度为0.028 8 mg·mL^-1，大黄酚质量浓度为0.061 9 mg·mL^-1）。

2.4.3 供试品溶液的制备

取小大黄粉末（过2号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称量，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，加36%盐酸3 mL，摇匀，置水浴上加热回流1 h，放冷，转移至50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液2、4、8、12、16、20 µL，分别在“2.4.1”项色谱条件下测定，以峰面积积分值Y对对照品进样量X（μg）进行线性回归，大黄素和大黄酚回归方程：

Y=4.104 9×10⁶X-4.082×10³ r=1.000 0

Y=5.392 7×10⁶X-4.894×10³ r=1.000 0

结果表明：大黄素和大黄酚进样量分别在0.058~0.576 µg、0.124~1.238 µg的范围内，与相应峰面积线性关系良好。

2.4.5 精密度试验

精密吸取“2.4.1”项下混合对照品溶液10 µL，连续进样6次，结果大黄素和大黄酚峰面积的RSD均为0.1%，表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液10 µL，于0、2、4、8、10、12 h分别进样分析，结果大黄素和大黄酚峰面积的RSD分别为0.8%、0.2%，表明供试品溶液中大黄素、大黄酚在12 h内稳定性良好。

2.4.7 重复性试验

取同一批次样品6份，分别按“2.4.3”项下方法制成供试品溶液，进样分析。结果大黄素和大黄酚含量的平均值分别为7.02、13.01 mg·g^-1，RSD分别为0.6%、1.6%，表明方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验

取已知含量（大黄素含量为3.19 mg·g^-1，大黄酚含量6.43 mg·g^-1）的小大黄样品粉末6份，每份约0.25 g，精密称定。精密加入混合对照品的甲醇溶液（大黄素和大黄酚质量浓度分别为0.017 42、0.330 6 mg·mL^-1）50 mL，按“2.4.3”项下方法制备供试溶液，进样10 µL进行测定，结果大黄素和大黄酚的平均回收率分别为102.8%、102.6%，RSD分别为0.9%、2.0%，表明回收率良好。

2.4.9 样品含量测定

取6批小大黄样品（每批取2份），按“2.4.3”项方法制成供试品溶液，进样10 µL进行测定，用外标法计算样品中大黄素和大黄酚的含量。测定结果见表 2。

3 讨论 3.1 检测波长的选择

根据大黄素和大黄酚的紫外光谱图，大黄素在在（252±2 nm）波长处有最大吸收峰，大黄酚在（256±2）nm波长处有最大吸收峰，因此综合考虑选择254 nm为检测波长。

3.2 含量测定提取方法的考察

试验中考察了中国药典2015年版一部中大黄药材项下含量测定方法和文中“2.4.3”项先超声后酸水解2种方法，经比较发现，先超声后酸水解的提取效果更好，方法更简便。

3.3 含量测定提取溶剂用量和时间的考察

试验中比较了加入36%盐酸2、3、4 mL的提取率。结果表明，加入36%盐酸3 mL和4 mL的结果一致，故选择3 mL为36%盐酸加入量。考察加热回流时间60 min和90 min，结果60 min和90 min的结果一致，故选择60 min为提取时间。

3.4 结果分析

由于本次研究仅收集到青海地区常用的小大黄药材6批，故未对同属其他植物进行试验研究。通过查阅相关文献可知，大黄（掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄）的草酸钙簇晶直径为20~160 µm，有的至190 µm；亚大黄（穗序大黄、疏枝大黄）的草酸钙簇晶直径为20~130 µm^[15]；而本次研究中6批小大黄药材的草酸钙簇晶直径为17~60 µm。小大黄与其他两类大黄的草酸钙簇晶直径差异明显，故草酸钙簇晶的大小可作为小大黄与同属其他植物的一个区别点。另TLC色谱图中，大黄对照药材（唐古特大黄）有5个橙黄色荧光主斑点，小大黄仅有3个，薄层色谱图差异明显。本文中又将小大黄标准药材和大黄素、大黄素甲醚、大黄酚混合对照品为对照进行薄层色谱鉴别，增强其专属性。因此，通过本文建立的显微鉴别和薄层色谱鉴别方法配合性状观察，可以有效地将小大黄与同属其他植物进行区分。

检查项测定结果表明，总灰分结果偏高，6批次样品的总灰分平均值为17.4%。作为总灰分的限量检查，主要是防止人为掺入加重物质，保证药用的安全性和有效性。故本文又对小大黄的酸不溶性灰分进行了测定，发现其酸不溶性灰分较低，平均值约为0.8%。说明小大黄的总灰分主要是生理灰分。

因小大黄药材中大黄素和大黄酚含量较高，故选取二者作为含量测定指标。经测定，6批小大黄药材中大黄酚的含量约为大黄素的2倍，而大黄素和大黄酚的总量差异很大，最高的为22.11 mg·g^-1，最少的为10.24 mg·g^-1，差异显著的原因可能是小大黄生长环境的不同造成的。因此，综合考虑暂定其限度为：本品按干燥品计算，含大黄素和大黄酚的总量不得少于8.0 mg·g^-1。