2018, Vol. 38 
2. 中药品质评价北京市重点实验室, 北京 100102
2. Beijing Key Laboratory for Quality Evaluation of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100102, China
中药鸡骨草为豆科植物广州相思子Abrus cantoniensis Hance的干燥全株，其性凉，味甘、微苦，归肝、胃经，有利湿退黄，清热解毒，疏肝止痛的功效[1]。鸡骨草最早出自《岭南采药录》，1977年被收入中国药典，在我国主要分布在广东、广西等地，并为两广的道地药材[2]。现代药理研究表明，鸡骨草具有保肝护肝、抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节、降脂等药理作用[3-9]，临床应用广泛。
鸡骨草所含化学成分复杂，其中黄酮、生物碱、三萜等类物质是鸡骨草的主要有效活性成分[10]。2015年版中国药典中，鸡骨草的鉴别是以相思子碱为指标的薄层色谱鉴别，并没有含量测定项，目前已有研究对其中生物碱类或黄酮类的个别成分进行含量测定[11-13]，希望以此进行质量控制，但中药成分复杂，仅以几个化合物的含量作为质量的评价指标是不全面的。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的色谱鉴定手段，该技术已被广泛用于中药的质量控制领域，因其可较全面地反映中药材及植物药产品的药效学物质特征，评价其稳定性及一致性而受到国际的认可[14-15]。故本实验建立鸡骨草的UPLC指纹图谱，并用相似度分析、聚类分析和主成分分析3种方法对不同产地鸡骨草药材的质量进行评价。
1 仪器与试药 1.1 仪器Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱仪，Waters Empower 3色谱工作站，含四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器(Waters公司)；Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm；填料：高强度硅胶键合十八烷基硅烷；Waters公司)；MS105DU分析天平(Mettler Toledo公司)；DK-98-1型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。
1.2 试药对照品相思子碱(批号PS160511-01)、下箴刺桐碱(批号PS13101403)、新西兰牡荆苷2(批号PS13071901)、夏佛塔苷(批号PS13031802)、原儿茶酸(批号PS09160025)、木犀草素(批号PS10320025)、大黄酚(批号12031501)购自成都普思生物科技有限公司，供含量测定用；乙腈、甲醇均为色谱纯(Fisher公司)，甲酸为色谱纯(北京化工厂)，水为屈臣氏纯净水。16批不同产地的鸡骨草信息见表 1，由广西药用植物园提供，并由北京中医药大学中药学院杨遥君副教授鉴定为广州相思子Abrus cantoniensis Hance的干燥全株。
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表 1 16批鸡骨草信息 Table 1 Sample information |
采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，ACQUITY UPLC柱在线过滤器，以乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱，洗脱程序见表 2，流速0.3 mL·min-1，检测波长254 nm，柱温35 ℃，进样量2 μL，理论塔板数均大于10 000。
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表 2 梯度洗脱程序 Table 2 Gradient elution program |
鸡骨草干燥全草粉碎过40目筛，取约1 g，精密称定，置索氏提取器内，加甲醇100 mL，水浴80 ℃加热2 h，提取液回收甲醇并浓缩至干，用80%的甲醇水溶解并转移至10 mL量瓶中，加80%的甲醇水定容至刻度，摇匀，过0.22 μm滤膜，取续滤液，即得。
2.3 混合对照品溶液的制备精密称取相思子碱、下箴刺桐碱、新西兰牡荆苷2、夏佛塔苷、原儿茶素、木犀草素、大黄酚的对照品适量，用70%甲醇水超声溶解并定容，制得相思子碱、下箴刺桐碱、新西兰牡荆苷2、夏佛塔苷、原儿茶素、木犀草素、大黄酚质量浓度分别为102.0、68.80、54.0、109.2、70.5、98.4、108.0 μg·mL-1的对照品储备液；分别取各对照品储备溶液5 mL至20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。
2.4 方法学考察 2.4.1 精密度试验取鸡骨草药材，按供试品溶液制备方法制备溶液，依法连续进样6次，测得各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均＜2%，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版本)”软件进行相似度评价，相似度均 > 0.996。表明仪器精密度良好。
2.4.2 稳定性试验取S7号样品制备供试品溶液1份，在“2.1”项色谱条件下进样分析，48 h内每间隔6 h测定1次，记录峰面积，考察色谱峰相似度的一致性，结果各共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD均＜1%，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版本)”软件进行相似度评价，相似度均 > 0.997，表明48 h内供试品溶液的成分是稳定的。
2.4.3 重复性试验取S7号样品制备供试品溶液6份，在“2.1”项色谱条件下进样分析，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版本)”软件进行相似度评价，相似度均 > 0.995。结果各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均 < 2%，表明重复性良好。
2.5 鸡骨草药材测定指纹图谱的建立取16批鸡骨草药材按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下检测，记录色谱图。将所有数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版本)”软件进行处理。S7号样品色谱图中色谱峰峰形、分离度良好，基线平整，故选择其为参照指纹图谱。为减小极端数据的影响，选择中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，时间窗宽度设为0.1，运用手动多点校正方法对色谱峰进行全谱峰匹配，见图 1，并生成对照指纹图谱。从16批鸡骨草药材的指纹图谱中共得到52个共有峰，见图 2。通过与对照品色谱图中的保留时间比对，初步可指认7个共有峰。
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图 1 16批鸡骨草药材色谱峰匹配图 Figure 1 Match chromatogram of 16 samples |
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3.原儿茶酸(protocatechuic acid) 7.相思子碱(abrine) 10.下箴刺桐碱(hypaphorine) 15.新西兰牡荆苷2(vicenin 2) 18.夏佛塔苷(schaftoside) 35.木犀草素(luteolin) 49.大黄酚(chrysophanol) 图 2 鸡骨草药材的共有模式图谱 Figure 2 Common pattern of 16 samples |
在上述数据处理的基础上，利用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版本)”软件对16批不同产地的鸡骨草药材进行相似度评价，结果见表 3。
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表 3 鸡骨草指纹图谱相似度评价 Table 3 Similarity of fingerprints of Abri Herba |
16批次鸡骨草药材图谱与对照指纹图谱的相似度范围为0.625~0.984，说明鸡骨草药材的质量存在一定差异。除了S6号样品(广西上思)和S13号样品(广西钦州)图谱与对照图谱的相似度小于0.80以外，其他各批次药材图谱与对照图谱的相似度均大于0.85，可见大部分药材质量比较接近；其中广西玉林的3个批次样品相似度较接近，质量稳定；而广西钦州的5个批次样品相似度有差异，质量各异；广东的2批栽培样品的相似度均小于0.9，明显低于大部分广西的栽培品。
2.6.2 聚类分析选择鸡骨草指纹图谱中52个共有峰，将其峰面积相对于称样量量化，将16份样品UPLC图谱中52个共有峰的峰面积值标准化，组成16×52阶原始数据矩阵，运用SPSS 20.0数据统计软件，选用平均组间连接聚类方法，利用平均欧式距离法作为样品间距离计算方法进行系统聚类分析，聚类结果见图 3。
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图 3 聚类分析结果 Figure 3 Results of hierarchical cluster analysis |
当判别距离为15和10时，16批鸡骨草药材被分为3类，S1~S12及S14、S15号样品为一类，S13号样品为一类，S16号样品为一类，即广东肇庆和广西钦州样品各为一类，其他产地样品分为一类；当判别距离为5时，S1~S12号样品为一类，即大部分广西产鸡骨草样品和越南产鸡骨草样品被聚为一类；S14、S15号样品为一类，2批广东的样品被聚为一类；S13和S16号样品即广东肇庆和广西钦州样品各聚为一类。总体看来，广西和广东的药材质量还是有差异的，可以各分一类。广西的药材质量大体相近，仅钦州的1个批次样品差别较大，表明即使是同一产地所产鸡骨草药材，质量也不尽相同，与相似度分析的评价结果相一致。
2.6.3 主成分分析用SPSS 20.0软件对量化的各共有峰峰面积进行标准化处理后，对16批鸡骨草药材指纹图谱所得的52个共有峰进行主成分分析，求出相关矩阵的特征值及其方差，见表 4。共提取出8个主成分，前3个因子的累积方差贡献率达到66.5%，前5个因子的累计方差贡献率达到85.6%，由于变量诸多，因此第1、2、3个因子分别作为主成分1、2和3，可代表鸡骨草指纹图谱共有峰的大部分信息。
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表 4 主成分特征值及方差 Table 4 Eigen value and total variance of principal components |
主成分载荷矩阵反映了各变量对主成分的贡献大小和作用方向。由于变量诸多，因此用52个共有峰3个主成分的排序坐标图来表示；由图 4可见，52个变量对主成分1多成正相关，其中共有峰22、34、38、40对其的贡献最大；共有峰3、15、25和49对主成分2贡献最大，其中共有峰3与主成分3呈负相关；共有峰5、11、14、17、19、28对主成分3的贡献最大，且共有峰11与主成分3呈负相关。
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图 4 52个共有峰3个主成分的排序坐标图 Figure 4 Coordinate diagram of three principal components in 52 common peaks |
进一步通过将各特征向量中心化和标准化后，16份样品主成分得分如图 5所示，并以样品的第1、2、3主成分得分做三维散点图，见图 6。第1主成分得分最高的为S16号样品，第2主成分得分最高的为S6、S16号样品，第3主成分得分最高为S13号样品。因此，通过以上分析结果可以得出2个产地的S6、S16号样品在第1、第2主成分中得分较高，而这2份样品均为野生的新采收药材，这就说明虽然不同产地鸡骨草的化学成分相似度较高，但从综合药用质量评价，还是野生的鸡骨草药材品质最佳。图 6中S1~S12号样品聚为一类，S14和S15号样品为一类，S13和S16号样品各为一类，这与相似度分析结果完全一致，而S6号样品在一类中比较靠边缘的地方，也与主成分分析的结果较一致。
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图 5 16批鸡骨草药材3个主成分的排序坐标图 Figure 5 Coordinate diagram of three principal components in 16 samples |
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图 6 主成分得分图 Figure 6 PCA score figure |
本实验对不同提取溶剂(纯甲醇、80%甲醇、50%甲醇)及不同提取方法(热回流提取、索氏提取、超声提取)进行考察，以色谱峰的信息最大化，提取效率最高，提取方法稳定可行为指标，最终选择纯甲醇为鸡骨草的提取溶剂，索氏提取法为实验提取方法。
本实验对色谱条件中的色谱柱、流动相体系和检测波长进行考察。考察了Waters的ACQUITY UPLC HSS T3 C18 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)以及Agilent UPLC SB C18 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm) 3款色谱柱，经比较发现，在相同色谱条件下，采用ACQUITY UPLC HSS T3柱能够得到最多的色谱峰，并且大部分达到基线分离，峰形更好，柱效更高。考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-0.2%甲酸水4种流动相体系，发现以甲醇-水为流动相，分离效果较差，改善色谱条件效果也不明显；以乙腈-水为流动相，分离效果较好，但峰形有拖尾，换用乙腈-0.1%甲酸水为流动相，峰形拖尾大有改善，换用0.2%甲酸水后峰形与0.1%甲酸水的峰形没有区别，因此以乙腈-0.1%甲酸水为流动相效果最佳。采用PDA检测器进行全波长扫描，比较各波长下指纹图谱的峰数、基线及响应值，最终选择254 nm为检测波长，此条件下，鸡骨草指纹图谱的峰数较多，响应均较高，且基线较平稳。
本实验依次运用相似度分析、聚类分析和主成分分析3种方法对不同产地的鸡骨草药材UPLC指纹图谱进行分析。16批次鸡骨草药材中有14批的指纹图谱相似度在0.85以上，只有2批药材的相似度小于0.80，说明不同产地的鸡骨草药材质量比较一致。从16批鸡骨草药材的指纹图谱中得到了52个共有色谱峰，共有峰个数较多，在已知的7个共有峰中包括了2个生物碱类成分、3个黄酮类成分、1个有机酸类成分和1个蒽醌类成分，说明通过本方法可较全面地反映鸡骨草药材的质量。从聚类分析结果可知，广东肇庆的S16号样品为野生药材单独聚为一类，S14、S15号2批广东栽培样品聚为一类，与广西的样品均不为一类，可见广西和广东药材质量还是有区别的；而S13号广西钦州样品单独聚为一类，可见即便是同一产地，也有个别批次药材质量有较大差异；16批样品中的4批野生药材，质量各异，只有广东肇庆的药材与栽培品有明显区别，2批越南的野生鸡骨草放置时间较长，可能影响了其质量。利用主成分分析将鸡骨草药材指纹图谱中的52个特征变量降维至8个主成分，选择前3个主成分来代表鸡骨草指纹图谱共有峰的大部分信息，由16份样品主成分得分图可知，S6和S16号2批样品为野生药材，质量较好，与栽培品有明显差别；三维散点图所得到的结果与聚类分析及相似度分析结果一致。本研究运用3种分析方法较全面地评价了不同产地鸡骨草的质量，为鸡骨草的质量控制研究奠定基础。此外，该指纹图谱中共有色谱峰众多，指认出的峰较少，对色谱峰的定性，还需要借助液质联用进行进一步确认和完善。
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