血尿胶囊收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂·第十七册》^[1]，由棕榈子、菝葜、薏苡仁3味药组成，清热利湿、凉血止血，临床上常用于治疗急、慢性肾盂肾炎血尿，肾小球肾炎血尿，泌尿系统结石引起的血尿以及不明原因引起的血尿等，亦可作为治疗泌尿系统肿瘤的辅助药物，是治疗血尿的首选中药制剂^[2]。方中3味药相辅相成，棕榈子收敛止血，其活性成分主要为原儿茶酸、儿茶素等^[3]，菝葜清热解毒、利湿散瘀，含有原儿茶酸、儿茶素、落新妇苷、黄杞苷、白藜芦醇及其苷类等活性成分^[4]，而薏苡仁渗湿利水，主要以薏苡仁油(甘油三酯类、脂肪酸类)^[5]为主。现代研究表明这些酚酸类^[6-7]、黄酮类^[4]、茋类及其苷类成分^[8]、薏苡仁油^[9]等均具有抗炎，抗病毒，抑制肿瘤，免疫调节等药理活性，这些药理活性成分与血尿胶囊的临床药效密切相关。酚酸、黄酮、黄杞苷等类成分，多属于极性较大的化合物且多有紫外吸收，故采用HPLC-UV进行分析研究，而极性较小且具有抗炎、抗肿瘤的薏苡仁脂肪油亦是血尿胶囊发挥临床药效必不可少的一部分，多用HPLC-蒸发光散射(ELSD)或者GC-MS进行检测。

血尿胶囊的质量控制标准为1998年部颁标准，质量控制方法单一，仅有检查、薄层鉴别项，缺少含量测定项，不能有效控制产品质量。目前已有蔡州、冯有龙、王海燕、杨玲等[3^，10-14]采用TLC、HPLC等技术集中于检测血尿胶囊中原儿茶酸成分，且文献报道时间偏早，也有部分厂家将血尿胶囊改为血尿片^[15]，并对其质量控制方法进行研究，但是其主要检测控制手段仍为HPLC法测定原儿茶酸的含量，而中药复方成分复杂，仅用TLC、HPLC控制单一成分无法全面反映其制剂内在质量。建立全面合理的指纹图谱，确定其特有的共有峰，已成为现代研究的必然趋势^[16]。

目前尚未见对血尿胶囊的指纹图谱研究报道，因而建立血尿胶囊的指纹图谱迫在眉睫。中药复方成分复杂，单张化学指纹图谱无法充分体现复方的整体特征，将2种及以上的色谱分析技术结合，可多方面反映复方的内在特征。血尿胶囊由3味药组成，方中薏苡仁在工艺制备中以生粉和提取的薏苡仁油入药，故仅用单一的HPLC-UV指纹图谱无法控制复方中薏苡仁油的质量。本文参考崔媛等^[16]所建立的将HPLC-ELSD与GC-MS融合而成的薏苡仁指纹图谱，将HPLC-UV与GC-MS这2种检测技术相结合，形成血尿复方整体融合指纹图谱，从而可以直观全面地分析其GC-MS指纹图谱部分和HPLC-UV指纹图谱部分，既可以监控血尿胶囊中脂肪油类成分，又可控制其极性较大的酚酸、黄酮等类成分，进一步达到全面控制血尿胶囊复方质量的目的。

1 仪器与试药

UltiMate 3000型高效液相色谱仪(戴安公司)；6890GC-5973MS型GC-MS仪(Aglient公司)；Waters XBridge C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Waters公司)；HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm；涂层：(5%-苯基)-甲基聚硅氧烷；安捷伦公司)；DV215CD型电子分析天平(十万分之一，Ohaus公司)；DZKW-4型水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)；乙腈、甲醇为色谱纯(西陇科学股份有限公司)，丙酮为分析纯(天津市申泰化学试剂有限公司)，其他试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

血尿胶囊由山西振东开元制药提供，批号20150504、20150912、20151205、20160308、20160604、20160911、20161123，编号对应为S1~S7；对照品原儿茶酸(批号110809-201205，含量99.9%)、儿茶素(批号110877-201604，含量99.2%)、绿原酸(批号110753-201415，含量96.2%)、咖啡酸(批号110885-200102，供鉴别或含量测定)、虎杖苷(批号111575-200502，供含量测定)、落新妇苷(批号111798-201504，含量93.9%)、黄杞苷(批号111906-201102，含量93.7%)、白藜芦醇(批号111535-200502，供含量测定)、槲皮素(批号100081-201509，含量98.6%)均购于中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果 2.1 HPLC及GC-MS分析条件 2.1.1 HPLC分析条件

采用Waters XBridge C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温25 ℃，以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)为流动相，梯度洗脱(0~30 min，5%A；30~45 min，5%A→13%A；45~75 min，13%A→20%A；75~85 min，20%A→25%A；85~100 min，25%A→35%A)，流速1.0 mL·min^-1；检测波长280 nm，进样量10 μL。

2.1.2 GC-MS分析条件

GC条件：采用HP-5MS色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，载气为氦气，体积流量为1.0 mL·min^-1，进样口温度250 ℃，柱温为程序升温(初始温度45 ℃，保持2 min，以5 ℃·min^-1程序升温至180 ℃，保持10 min，后以10 ℃·min^-1程序升温至250 ℃，保持10 min)，进样量1 μL，分流比20:1；质谱条件：标准谱图调谐，电离方式EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，数据采集扫描模式为全扫描，质量范围m/z 50~550。

2.2 溶液制备 2.2.1 HPLC供试品溶液

取本品内容物(10粒混合均匀)约2 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称量，回流提取60 min，放冷，甲醇补足减失的量，过滤，精密量取续滤液25 mL置蒸发皿中，挥干溶剂，残渣加适量50%乙腈水溶解并定容至2 mL，进样前以0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.2 混合对照品溶液

取原儿茶酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、虎杖苷、落新妇苷、黄杞苷、白藜芦醇、槲皮素的对照品适量，精密称定，加甲醇制备质量浓度分别为0.950、1.220、1.130、1.095、1.090、1.080、1.180、0.855、1.015 mg·mL^-1的对照品储备液。分别精密吸取原儿茶酸对照品储备液300 μL，儿茶素对照品储备液200 μL，其余对照品储备液各100 μL，混合均匀，制成混合对照品溶液。

2.2.3 GC-MS供试品溶液

取样品适量，加10倍量丙酮回流提取2 h，滤过，减压浓缩得样品脂肪油；取脂肪油0.2 g，精密称定，精密加入10%浓硫酸-甲醇(10:90)混合液4 mL，70 ℃回流提取2 h，冷却，精密加入4 mL正己烷萃取，萃取液用无水Na₂SO₄干燥，0.45 μm微孔滤膜滤过，即可。

2.3 指纹图谱数据融合方法

取血尿胶囊样品的HPLC供试品溶液及GC-MS供试品溶液，分别按照“2.1.1”、“2.1.2”项下条件分别测定，将分析后得到的GC-MS和HPLC的色谱响应数据及色谱峰数据导入软件Microsoft Office Excel 2007进行归一化处理，并按照同等生药量进行换算，之后按照保留时间进行叠加融合，并导出为txt格式，最后将所得融合数据导入国家药典委员会制定的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2.0版》，即可得到血尿胶囊的融合指纹图谱。

2.4 方法学考察 2.4.1 精密度考察

取同一批样品内容物，按照“2.2.1”、“2.2.3”项下方法分别制备HPLC供试品溶液及GC-MS供试品溶液，分别按各自的分析条件进样测定6次，并将所得结果进行分析、融合；从结果可知，所得融合指纹图谱各共有峰相对保留时间的RSD均＜1.1%，相对峰面积的RSD均＜3.0%，说明方法的精密度良好。

2.4.2 稳定性考察

取HPLC供试品溶液及GC-MS供试品溶液，按照各自的分析条件分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，将所得数据按“2.3”项下方法进行融合，计算各共有峰相对保留时间的RSD均＜1.5%，相对峰面积的RSD均＜5.0%，表明按照“2.2.1”、“2.2.3”项下方法制备的供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.4.3 重复性考察

取同一批样品内容物，按照“2.2.1”、“2.2.3”项下方法分别平行制备HPLC供试品溶液及GC-MS供试品溶液各6份，进样测定，并将所得色谱数据进行分析、融合，计算各共有峰相对保留时间的RSD均＜1.8%，相对峰面积的RSD基本＜5.0%，说明方法重复性良好。

2.5 融合指纹图谱的建立与评价 2.5.1 血尿胶囊HPLC指纹图谱

取HPLC供试品溶液及混合对照品溶液，按“2.1.1”项下条件进样分析，所得血尿胶囊HPLC指纹图谱经过与混合对照品图谱比对，指认出9个色谱峰，结果表明2号峰为原儿茶酸，6号峰为儿茶素，7号峰为绿原酸，8号峰为咖啡酸，14号峰为虎杖苷，16号峰为落新妇苷，19号峰为黄杞苷，20号峰为白藜芦醇，21号峰为槲皮素。样品与混合对照品的色谱图见图 1。

2.5.2 血尿胶囊GC-MS图谱

取GC-MS供试品溶液，按照“2.1.2”项下的条件进行GC-MS分析，所得血尿复方中脂肪油甲酯化GC-MS总离子流图见图 2。图 2中12个共有峰代表的脂肪酸类成分经NIST 2008数据库(安捷伦公司)检索并结合质谱鉴定，确定化合物为棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯、9，12-十八碳二烯酸甲酯、(E)-9-十八烯酸甲酯、硬脂酸甲酯、亚油酸乙酯、油酸乙酯、7，10-十八碳二烯酸甲酯、硬脂酸乙酯、11-二十烯酸甲酯、二十酸甲酯、二十二酸甲酯，具体离子裂解见表 1。

2.5.3 融合指纹图谱的建立

按照“2.3”项下方法数据归一化处理后，前半部分是GC指纹图谱的数据，后半部分为HPLC指纹图谱的数据，得到血尿复方脂肪油融合指纹图谱，融合图谱中t_R 0~16.5 min为GC-MS检测图谱，t_R16.5 min之后为HPLC检测图谱，结果见图 3，确定了34个共有峰，合并“2.5.1”与“2.5.2”项下分析所得化合物，鉴定出21个化合物的结构。

2.6 参照峰的选择及共有峰的标定

根据7批血尿胶囊融合指纹图谱测定结果，选择融合指纹图谱中1号峰棕榈酸甲酯为参照色谱峰，因其峰面积较大，稳定性好，分离度较高，作为参照峰是较为合理可行的。S1~S7共7批血尿胶囊共有峰的相对保留时间及相对峰面积见表 2、表 3。

2.7 相似度评价

将7批血尿胶囊HPLC、GC-MS及融合指纹图谱数据导入国家药典委员会制定的《中药指纹图谱相似度计算软件2.0版》，以S1为参照图谱经多点校正及色谱峰匹配，得出7批血尿胶囊的HPLC、GC-MS以及融合指纹图谱匹配图谱分别见图 4~6，并分别计算出相似度，其结果均在0.99以上，结果见表 4。由表 4可知，将HPLC与GC-MS融合之后建立的血尿胶囊指纹图谱相似度与单独的HPLC及GC-MS指纹图谱相似度相差不大，相似度均在0.99以上，而仅建立单独的HPLC或GC-MS指纹图谱均不能完全体现血尿胶囊的整体特征，而融合指纹图谱则直观全面地分析血尿胶囊的内在特征，囊括了极性差别较大的2种化学成分，有其独特的优势。

3 讨论

中药成分复杂，复方中药更复杂，在质量控制标准中仅检测个别成分无法全面反映其制剂内在特征。中药指纹图谱作为一种综合的、全面的鉴别模式，充分反映中药复方的“整体性”与“模糊性”，可有效监控中药复方制剂的质量^[17]。血尿胶囊由棕榈子、菝葜、薏苡仁3味药组成，根据血尿胶囊制备工艺的独特性，在进行HPLC-UV指纹图谱研究时，对血尿胶囊及各单味药在200~400 nm进行紫外全波长扫描，故考虑选择220、280、320 nm 3个紫外波长，在进行HPLC色谱条件考察时，筛选了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水、乙腈-醋酸水等流动相，最终确定280 nm为测定波长，以乙腈-0.1%磷酸水为流动相进行梯度洗脱。在考察GC-MS分析条件时，筛选不同的程序升温条件及样品分流比进样，最终以3阶段程序升温，分流比20:1较为合适。

血尿胶囊现行部颁标准中没有含量测定项，文献研究也仅局限于HPLC法测定单一成分原儿茶酸的含量，从方中组成及所含成分的分析，如仅用单一的HPLC指纹图谱控制原儿茶酸、儿茶素、白藜芦醇等成分，并不能完全反映血尿胶囊各味药材的特征，本实验将建立的HPLC和GC-MS采集数据分别进行归一化处理，联合表达的融合指纹图谱包含了更丰富、较为全面的化学成分信息，方法简单易行，所得图谱直观清晰，但是所建立的融合指纹图谱数据为归一化处理后的数据，在保证等量生药量的前提下，2种方法的串联结合，难免造成一定的误差，但是将2种方法融合可以更全面地控制血尿胶囊的整体质量，也为成分极性差异较大中药复方制剂质量控制提供了方法学的参考，可以考虑在之后的研究中将3种或者更多的检测手段，采用更为先进的技术进行更为合理的方法融合。在进行血尿胶囊相似度评价时，因本品保质期及收集时间短，故收集的血尿胶囊批次偏少，在接下来的研究中应增加血尿胶囊的批次，以便进行更加科学合理的实验研究。