鹅不食草为菊科石胡荽属植物鹅不食草Centipeda minima (L.) A. Br. et Aschers.的干燥全草，具有发散风寒，通鼻窍，止咳的功效，用于风寒头痛，咳嗽痰多，鼻塞不通，鼻渊流涕，现收载于中国药典2015年版一部中^[1]，产于我国东北、华北、华中、华南、西南等地^[2]，是中国药典2015年版一部中华跌打丸、芩芷鼻炎糖浆、通关散、鼻炎康片等中成药的组方药材之一。据文献报道鹅不食草中含有黄酮、苯丙素、倍半萜等类化学成分^[3-9]。现代药理研究表明，鹅不食草的水提物具有抗氧化和抗炎活性^[10]。

现行的2015年版中国药典标准鹅不食草项下缺少含量测定等项目。鹅不食草的含量测定方面有一些文献报道：杨艳芳等^[11]采用HPLC法测定不同采收时间鹅不食草中山金车内酯C和短叶老鹳草素2个倍半萜内酯的含量；韦文芳等^[12]采用HPLC法测定了鹅不食草中槲皮素和山柰酚的含量。本研究采用HPLC法建立鹅不食草的特征图谱，并同时测定绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C共7个活性成分，探索建立鹅不食草含量测定项目的指标性成分，为鹅不食草质量标准的提高提供科学依据。

1 仪器、试药及样品 1.1 仪器

安捷伦公司1260型液相色谱仪、二极管阵列检测器，沃特世公司Waters HSS T3 C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶)，赛多利斯公司QUINTIX313-1CN型万分之一电子天平，赛多利斯公司MSE125S型十万分之一电子天平，江苏昆山市超声仪器有限公司KQ-500DV型超声波清洗器，密理博公司Milli-Q去离子水发生器。北京科迈恩科技有限公司Chempattern化学计量学软件。

1.2 试药

绿原酸(批号110753-201314)、咖啡酸(批号110885-200102)、芦丁(批号110080-201610)、异绿原酸A(批号111782-201405)、异绿原酸C(批号111894-201102)由中国食品药品检定研究院提供，隐绿原酸(批号MUST-16022403)、异绿原酸B(批号MUST-16031612)由成都曼斯特生物科技有限公司提供，HPLC-DAD(面积归一化法)检测纯度均大于98.0%。甲醇、乙腈、三氟乙酸均为色谱纯，为Fisher公司产品；水为Milli-Q纯化水。

1.3 样品

药材样品均来自2016年国家药材抽验计划抽检样品，经中国食品药品检定研究院民族药室郑健研究员鉴定为菊科石胡荽属植物鹅不食草Centipeda minima (L.) A. Br. et Aschers.的干燥全草。

2 溶液的制备 2.1 混合对照品溶液

取绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的对照品适量，分别置100 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成上述7个成分质量浓度分别为102.1、93.6、95.2、93.2、92.8、96.4、92.7 μg·mL^-1的溶液，即得各对照品储备液；依次取上述7个成分的对照品储备液1、0.5、0.5、0.5、0.5、2、1 mL，置同一个10 mL量瓶中，加甲醇配制成上述7个成分分别为10.21、4.68、4.76、4.66、4.64、19.28、9.27 μg·mL^-1的混合溶液，即得。

2.2 供试品溶液

取样品粉末(过4号筛)0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，称量，超声(功率300 W，频率40 kHz)处理30 min，放冷，再称量，用50%甲醇补足减失的量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

3 色谱条件

采用Waters HSS T3 C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.08%三氟乙酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0~13 min，10%A→11%A；13~18 min，11%A→15%A；18~29 min，15%A→17%A；29~50 min，17%A)，流速1.0 mL·min^-1，检测波长325 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

4 特征图谱 4.1 鹅不食草特征图谱的建立

取不同批次的鹅不食草(1~20号样品)粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，分别进样测定，记录50 min的HPLC色谱图(见图 1)。根据结果，采用Chempattern化学计量学软件进行数据分析处理，设定1号样品的图谱为参照图谱，将其他样品的色谱图与参照图谱进行自动匹配，生成鹅不食草的特征图谱(见图 2)。

4.2 方法学考察 4.2.1 精密度试验

精密吸取同一鹅不食草供试品溶液(1号样品)10 μL，按上述色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图。以异绿原酸A峰为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD < 1%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积的RSD < 2%；采用Chempattern化学计量学软件进行评价，相似度为0.99。结果表明仪器精密度良好。

4.2.2 稳定性试验

精密吸取同一鹅不食草供试品溶液(1号样品)10 μL，分别于0、2、4、6、8、12、24 h按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。以异绿原酸A峰为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD < 1%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积的RSD < 2%；采用Chempattern化学计量学软件进行评价，相似度为0.99。结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

4.2.3 重复性试验

取同一批鹅不食草样品粉末(1号样品) 6份，精密称定，按“2.2”项下方法分别制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，分别进样测定，记录色谱图。以异绿原酸A峰为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD < 1%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积的RSD < 2%；采用Chempattern化学计量学软件进行评价，相似度为0.99。结果表明该方法重复性好。

4.3 特征图谱结果分析

根据20批样品的特征图谱分析结果，鹅不食草主要有12个特征共有峰。经过与对照品比对，标定7个特征峰，2号峰为绿原酸，3号峰为隐绿原酸，4号峰为咖啡酸，7号峰为芦丁，10号峰为异绿原酸B，11号峰为异绿原酸A，12号峰为异绿原酸C，其他峰为未知成分。

以11号峰为参照峰分别计算各特征共有峰相对保留时间与相对峰面积，结果峰号(平均相对保留时间、平均相对峰面积)分别为峰1(0.199、0.082)、峰2(0.303、0.317)、峰3(0.333、0.080)、峰4(0.428、0.069)、峰5(0.465、0.130)、峰6(0.524、0.036)、峰7(0.740、0.095)、峰8(0.862、0.064)、峰9(0.899、0.046)、峰10(0.929、0.066)、峰11(1.000、1.000)、峰12(1.102、0.431)。

采用Chempattern化学计量学软件以特征图谱为参照，计算1~20号鹅不食草样品图谱与特征图谱的相似度，分别为0.952、0.880、0.970、0.877、0.952、0.881、0.919、0.956、0.924、0.901、0.897、0.936、0.882、0.966、0.959、0.969、0.968、0.965、0.974、0.829。结果显示，各批次鹅不食草图谱与特征图谱之间相似度均大于0.80，相似度较好。

5 鹅不食草中7个成分的含量测定 5.1 系统适用性试验

按“3”项下色谱条件进行检测，以异绿原酸A峰计算理论塔板数大于6 000，分离度大于1.5。对照品及样品的色谱图见图 3。

5.2 线性关系考察

精密吸取各对照品储备液均为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，分别一一对应置于5个10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得各系列浓度的混合对照品溶液。分别精密吸取各系列浓度混合对照品溶液及对照品储备液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，以各对照品质量浓度(μg·mL^-1)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表 1，表明各化合物在相应线性范围内线性关系良好。

5.3 检测限与定量限测定

取“2.1”项下混合对照品溶液用甲醇逐级稀释后进样测定，测得绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C的检测限(S/N=3)分别为0.15、0.21、0.27、0.18、0.22、0.21和0.24 ng，定量限(S/N=10)分别为0.45、0.67、0.51、0.55、0.67、0.61和0.88 ng。

5.4 精密度试验

精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积。结果绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C峰面积的RSD(n=6)分别为0.15%、0.12%、0.18%、0.35%、0.12%、0.11%、0.25%，表明仪器精密度良好。

5.5 重复性考察

取样品粉末(1号样品)6份，分别按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“3”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算含量及RSD。结果各份供试品溶液的绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C的平均含量分别为0.060%、0.029%、0.022%、0.093%、0.024%、0.127%、0.084%，RSD分别为1.2%、1.4%、1.8%、1.8%、1.4%、1.7%、1.7%，表明重复性良好。

5.6 溶液稳定性试验

取同一份供试品溶液(1号样品)，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定。结果绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C峰面积的RSD(n=6)分别为0.63%、0.91%、0.75%、1.0%、1.2%，0.58%和0.79%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

5.7 加样回收率试验

取已知含量鹅不食草样品粉末6份(1号样品)，每份约0.15 g，置具塞锥形瓶中，精密加入各对照品溶液(绿原酸90.6 μg·mL^-1，隐绿原酸41.5 μg·mL^-1，咖啡酸30.8 μg·mL^-1，芦丁145.3 μg·mL^-1，异绿原酸B 35.1 μg·mL^-1，异绿原酸A 205.3 μg·mL^-1，异绿原酸C 122.3 μg·mL^-1)各1 mL，分别按照“2.2”项下方法制备供试溶液，按“3”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率，结果绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C平均加样回收率(n=6)分别为98.6%、98.3%、98.0%、98.1%、99.1%、98.8%和97.4%，RSD分别为1.7%、1.7%、2.3%、1.6%、2.6%、1.8%和2.3%。

5.8 鹅不食草7个成分含量测定

每个样品取2份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取各供试品溶液10 μL，按“3”项下色谱条件进行测定，用外标法计算出含量，结果见表 2。

6 讨论 6.1 色谱条件的选择

本文采用梯度洗脱法分离鹅不食草中的7个主要化学成分，50 min内完成分离，绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C分离效果良好，符合含量测定要求。本文通过二极管阵列检测器进行全波长扫描(190~400 nm)，结果325 nm时7个化学成分均有较大吸收，且杂质成分干扰少，故选择325 nm作为检测波长。流动相优选时分别考察了乙腈-甲酸水、乙腈-磷酸水、乙腈-三氟乙酸水等流动相系统，最终选择乙腈-0.08%三氟乙酸水溶液为流动相。样品中各成分色谱峰分离度好，故最终确定此流动相。

6.2 特征图谱分析

20批鹅不食草均含有12个特征峰，虽然各批次间有一定差异，但相似度评价结果表明，20批鹅不食草的HPLC图谱与特征图谱之间的相似度均在0.80以上，各特征峰之间规律性较强，具有较好的一致性，可作为药材的质量评价方法。通过对照品比对法，标定了7个主要特征峰。因此，建立的特征图谱具有较强的专属性，对于鉴定鹅不食草药材具有参考意义。

6.3 含量测定

由表 2可见，20批鹅不食草中均含有绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C 7个化学成分。不同批次之间各成分含量有一定差异，但20批药材中含量最高的均为异绿原酸A，含量范围为0.032%~0.263%，平均为(0.115±0.066)%；异绿原酸C含量范围为0.012%~0.100%，平均为(0.050±0.026)%，并且异绿原酸A的含量全部高于异绿原酸C的含量，两者含量比值在1.2~4.0倍，该比值具有一定的鉴别意义。隐绿原酸、咖啡酸和异绿原酸B含量过低，不宜作为含量测定指标；绿原酸和芦丁专属性较低；结合色谱峰出峰位置，可考虑以异绿原酸A和异绿原酸C含量之和为含量指限度指标，异绿原酸A和异绿原酸C含量之和范围为0.044%~0.361%，平均为(0.165±0.088)%。

6.4 小结

本实验在同一色谱条件下，建立了鹅不食草的特征图谱，并同时测定不同批次鹅不食草中绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C 7个有效成分的含量，方法简便、快速、准确，具备了定性和定量双重作用，为有效控制鹅不食草的质量提供了科学依据。