吸烟有害健康，长期吸烟，容易得肺病、心血管疾病、癌症以及骨质疏松等多种疾病^[1-2]。我国当前吸烟人数超过3亿，每年有100多万人死于烟草相关疾病，超过艾滋病、结核、交通事故以及自杀等导致死亡人数的总和^[3-4]。香烟含有多种有害成分，其中烟碱(又称尼古丁)是导致烟瘾的罪魁祸首，研究烟碱的急性中毒以及积极探索降低烟碱毒副作用的药物有着重要的意义。据报道，菊科植物中华苦荬菜鲜品口服制剂对烟碱中毒家兔和小白鼠具有明显的解救作用^[5]；对小鼠尼古丁急、慢性中毒有一定的拮抗作用，对尼古丁依赖的戒断症状有明显的改善作用^[6-7]。野菊花属于菊科野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥头状花序，是我国的传统中药，能清热解毒，疏风平肝^[8]。现代研究表明，野菊花具有抗菌、抗炎^[9]、抗氧化^[10]、抗肿瘤^[11-12]等作用，野菊花及复方制剂可用于预防和治疗呼吸系统、泌尿系统、皮肤等的感染性疾病，以及高血压、高血脂等^[13-14]。菊科植物具有相近的次生代谢产物以及相似的生物活性，而野菊花抑制烟碱毒性目前尚未见报道。为此作者开展了野菊花抗烟碱毒性的研究，为从野菊花中研发烟碱解毒药提供科学依据。

1 实验材料

XS105型精密电子天平(METTLER TOLEDO公司)；DZG-303A型超纯水机(艾柯仪器厂)；KQ-500DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；微量移液管(泰州为尔康医用品有限公司)；小鼠灌胃器(上海玉研科学仪器有限公司)。

烟碱:无色油状液体，含量99%，密度1.01 g·mL^-1，由中国烟草总公司郑州烟草研究院提供，批号2015-07A。因为烟碱具有能溶于水的性质，又实验所用烟碱浓度很小，所以所配烟碱溶液溶解充分。使用前用蒸馏水配制所需浓度的烟碱稀溶液；例如:配制3.0 mg·mL^-1的烟碱溶液，先用微量移液管量取29.7 μL烟碱加到盛有适量蒸馏水的10 mL量瓶中，再用蒸馏水定容至刻度线，加塞摇匀即可。

野菊花乙醇提取物(ethanol extracts of Chrysanthemi Indici Flos，EECI):野菊花采自河南省信阳市大别山区，标本存于河南应用技术职业学院应用技术研究中心607标本室，标本号201511；将风干的300 g野菊花研碎，加入3 L 93%的乙醇水溶液浸泡提取3次，合并提取液，减压蒸干，获得野菊花乙醇提取物(EECI)。将一定量的EECI分散于去离子水中(加CMC-Na助溶，水中含CMC-Na为0.7%)，配制成不同浓度的混悬液，置于功率为800 W超声仪中，在40 ℃下超声10 min，使其分散均匀，即得EECI混悬。

实验动物:健康级(SPF)昆明种小白鼠，全雌，8周龄，体重18~22 g，由河南省实验动物中心提供。购回后分装于鼠笼中，置于20~25 ℃空调房中，标准饲料、自来水喂养，适应2~3 d后用于实验，实验前小白鼠禁食12 h，只提供充足饮水。

2 实验方法 2.1 给药方式与给药体积

用灌胃器直接给小白鼠灌胃给药，给药量标准为每10 g小白鼠单次灌胃给药量是0.25 mL。

2.2 烟碱最大致死量(LD₁₀₀)的测定

烟碱最大致死量(absolute lethal dose，LD₁₀₀)是指使小白鼠全数死亡的烟碱最低剂量。用微量移液管分别量取不同量的烟碱于10 mL量瓶中，用蒸馏水配制成不同浓度的烟碱溶液。给空腹12 h的小白鼠先灌胃去离子水，20 min后灌胃不同浓度的烟碱溶液，立即观察动物的反应，记录3 d内小白鼠死亡时间和死亡数目。随着烟碱浓度的增加，实验小白鼠反应逐渐强烈，死亡数逐渐增加。当小白鼠刚好全数死亡时的烟碱的剂量即为烟碱最大致死量LD₁₀₀。多次实验表明，染毒小白鼠在30 min内可能死亡，30 min至3 d内未见新的死亡(3 h后正常喂养)。实验测得LD₁₀₀为75 mg·kg^-1。再根据“2.1”项下给药体积的标准，最大致死量烟碱溶液的质量浓度为3.0 mg·mL^-1。

2.3 预试验

预试验的目的是测出EECI抗烟碱毒性的最大保护剂量(PD₁₀₀)和最小保护剂量(PD₀)的估计值。取准备好的25只小白鼠，随机等分成5组。照毒理学规定的程序，采用EECI剂量逐步递减法进行预试验^[15-16]。按以上所述方法配制5种不同浓度的EECI混悬液(0.25、0.20、0.13、0.06、0.03 g·mL^-1)，依次进行实验。首先给小白鼠灌胃上述不同浓度的EECI混悬液，20 min后灌胃最大致死量的烟碱溶液(75 mg·kg^-1)，观察动物的反应，记录3 h内小白鼠死亡数目。预试验确定PD₁₀₀为6.25 g·kg^-1，PD₀为0.625 g·kg^-1。

2.4 正式试验 2.4.1 分组与剂量

分组以4~9组为宜，本次正式实验分为8组。再根据预试验结果，按照毒理学的计算公式^[17-18]和实验组数，首先计算出相邻两组剂量的组距i: i=(lg PD₁₀₀-lg PD₀)/(n-1)，代入数据得到i=(lg 6.25-lg 0.625)/7=0.143，再计算出相邻两组剂量的公比d: d=log^-1i=1.39。分组与剂量如表 1所示。

2.4.2 给药方案

将90只小白鼠随机等分成9组，每组10只，分别为1个对照组和8个实验组，以去离子水为对照组，正式试验的剂量如表 1，方法同预试验。

2.4.3 半数保护剂量(PD₅₀)的计算

以Bliss法为原理，运用SPSS(Statistical Package for the Social Science)软件编辑运算^[19]，得到本次实验EECI抗最大致死量烟碱毒性的半数保护量PD₅₀和95%可信限。

3 结果

对照组小白鼠烟碱中毒后，出现兴奋，呼吸急促，尾巴高高翘起，沿着鼠笼不停跑动，身体抽搐，其中有2只口中流血，最后全部死亡。而实验组小白鼠中毒症状有所缓解，存活小白鼠数随EECI剂量的增加而增加。能够存活的小白鼠开始时活动减少，身体萎缩，随后活动逐渐增加，1~3 h活动正常。特别是EECI高剂量的6、7、8组，小白鼠中毒症状轻微，没有出现强烈的兴奋、呼吸困难、翘尾、抽搐等现象，且在5 ~15 min内症状缓解，随后逐渐趋于平稳，1 h后活动正常，觅食，没有发现死亡现象。实验结果如表 2所示。

通过计算，本次实验EECI抗烟碱毒性的半数保护量PD₅₀为1.53 g·kg^-1，其95%可信限为1.20~1.90 g·kg^-1。

4 讨论

实验结果表明，染毒小白鼠的存活时间随EECI剂量增加而延长，小白鼠的存活率与EECI剂量呈依赖关系，剂量越高，小白鼠存活率越高，最终完全抑制烟碱毒性。EECI半数保护量PD₅₀为1.53 g·kg^-1，95%可信限为1.20~1.90 g·kg^-1。EECI具有抗烟碱毒性的生物活性。

野菊花含有挥发油、萜类、黄酮类等多种化学成分^[20-22]，临床多用于治疗高血压、高脂血、肿瘤等症，以及泌尿生殖系统感染、急慢性呼吸道感染、急性乳腺炎、急性感染性肝炎以及急性淋巴管炎等各种感染性疾病，预防流行性脑膜炎、感冒也有一定作用^[23-25]。本文首次报道野菊花具有抗烟碱毒性的生物活性，拓展了野菊花的应用范围，为进一步从中药野菊花中寻找烟碱解毒药提供了科学依据。同时作者也认识到，本文研究PD₅₀数值是一个统计学估计值，受实验动物、样品的溶解度、操作人员的操作技能等方面的影响。作者前期研究发现，菊科植物的萜类成分具有抗尼古丁毒性的生物活性^[26]，推测野菊花具有抗烟碱毒性的活性物质可能是萜类，其具体的活性化学物质及其解毒机理有待于进一步探索。