樱子为蔷薇科植物金樱子Rosa laevigata Michx.的干燥的果实，其性味酸、甘、涩、平，归肾、膀胱、大肠经，具有固精缩尿、固崩止带、涩肠止泻的功效，用于遗精滑精、遗尿尿频、崩漏带下、久泻久痢^[1]。其始载于《蜀本草》，《本草纲目》记载金樱子主治脾泻下痢，有止小便利，涩精气，补血益精的功效。现代研究表明，金樱子化学成分主要含有多糖、酚类^[2]、黄酮^[3]、甾体、三萜化合物及其衍生物、木质素和鞣质等^[4]化合物，含有柠檬酸、鞣质、苹果酸、维生素、20多种氨基酸、24种矿物质^[5]，具有抗氧化^[6-7]，保护心肌^[8-9]，保护肾脏^[10]，免疫调节^[11]，降糖^[12]，抗肿瘤^[13]，抗病毒^[14]，保肝护肝^[15-16]等多种药理作用。20世纪80年代初，金樱子制成的滴眼液在临床上治疗单纯疱疹病毒性角膜炎取得较好疗效^[14]，说明金樱子具有抗病毒的作用，但其在抗病毒领域的研究尚处于起步阶段。本研究选取呼吸道合胞病毒（RSV）、单纯疱疹病毒（HSV-1）、柯萨奇病毒（COX-B5）和手足口病毒（EV71），以利巴韦林（为抗RSV，COX-B5，EV71的阳性对照药，）和阿昔洛韦（HSV-1的阳性对照药）为阳性对照药，进行金樱子不同溶剂萃取物体外抗病毒研究，为建立金樱子抗病毒谱-效模型提供科学依据和数据支撑，为抗病毒体内实验的研究奠定基础。

1 实验材料 1.1 药品

金樱子药材（购买于济南建联中药店，经山东中医药大学徐凌川教授鉴定为蔷薇科植物金樱子Rosa laevigata Michx.的干燥果实）；利巴韦林（山东鲁抗辰欣药业有限公司，批号1410206811）；阿昔洛韦（亚宝药业制药有限公司，批号15062005）。

1.2 宿主细胞及病毒毒种

Hep-2（人喉癌细胞，为RSV，COX-B5，HSV-1宿主细胞）、RD（人横纹肌肉瘤细胞，为EV71宿主细胞）、RSV、COX-B5、HSV-1、EV71、由山东省医学科学院基础医学研究所提供，本研究室保存。

1.3 主要试剂

细胞培养液（HyClone公司，批号AAJ207653），含10%新生牛血清及100 U·mL^-1青霉素和链霉素，过滤除菌，分装置4 ℃备用；2%维持液，含2%新生牛血清及100 U·mL^-1青霉素和链霉素，过滤除菌，分装置4 ℃备用；新生牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批号141013）；PBS磷酸盐缓冲液（HyClone公司，批号AAK2-8442）；EDTA-0.25%胰酶（Gibco公司，批号1737903）；Cell Counting Kit-8试剂盒（CCK-8 kit）（上海碧云天生物技术有限公司，编号C0039）；乙醇等化学试剂均为分析纯。

1.4 实验仪器

CO₂恒温培养箱（上海力申科学仪器有限公司，HF90）；倒置显微镜（Olympus公司，CKX-31）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，HFsafe-1200TE）；酶标仪（Molecular Device，Spectra Max M5）。

2 实验方法 2.1 供试品溶液的制备

称取金樱子粉末（过40目筛）500 g，用10倍量75%的乙醇回流提取2 h，过滤，滤渣再加8倍量75%乙醇回流提取2 h，过滤，合并滤液，3 000 r·min^-1离心15 min，取上清液抽滤，回收乙醇，减压浓缩成浸膏，真空干燥，得醇提物50 g。取48 g醇提物，加水混悬，分别使用同体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取4次，减压浓缩干燥，得石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物分别为7.3、5.4、4.7、7.5 g，剩余水液部分干燥后得22.1 g。取醇提物、石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、剩余水液部分适量，用2%的DMSO溶液配成16 mg·mL^-1的溶液，即为不同溶剂萃取物的供试品溶液。

2.2 阳性对照药溶液的配制

取利巴韦林和阿昔洛韦适量，用2%的DMSO溶液配成50 mg·mL^-1的溶液作为阳性对照药供试品溶液。

2.3 病毒的扩增

将病毒株（RSV、HSV-1、COX-B5、EV71）200 μL接种于已经长成单层的Hep-2和RD细胞上，吸附30 min后加入2%维持液10 mL，置37 ℃、5% CO₂病毒培养箱中培养并设细胞对照，每隔4 h观察1次，当细胞出现90%以上的病变时，取出，反复冻融3次（-80 ℃超低温冰箱内每次冻1 h），吹打离心（1 000 r·min^-1，20 min），取上清液定量分装，放于-80 ℃超低温冰箱内保存待用。

2.4 病毒毒力的测定 2.4.1 制备多孔板内单层细胞

将细胞培养瓶内Hep-2、RD细胞消化，以每1 mL 10⁵个细胞浓度接种96孔板，每孔100 μL，37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，24 h后使用。

2.4.2 病毒毒力的测定

将上述扩增好的病毒用2%维持液做10倍比系列稀释，稀释10个梯度，纵向重复4孔，依次接种于长成单层细胞的96孔板中；同时设细胞对照及空白对照，置37 ℃、5% CO₂病毒培养箱中培养，倒置显微镜观察，细胞出现90%以上病变时终止培养，按照Cell Counting Kit-8试剂盒操作（每孔加10 μL CCK-8染液染色，置37 ℃、5% CO₂病毒培养箱中培养3 h，用酶标仪在450 nm波长测定吸光度A），根据Reed-Muench公式计算病毒液的半数感染量TCID₅₀，结果见表 1。细胞病变率=1-细胞存活率，存活率=（病变孔A值-空白孔A值）/（细胞对照孔A值-空白孔A值），比距=（高于50%存活率-50%）/（高于50%存活率-低于50%存活率），TCID_5o=Antilg（Ig高于50%CPE百分率病毒稀释度+比距×稀释因子对数）。

2.5 药物对细胞毒性的测定

将不同溶剂萃取物的供试品溶液用2%维持液按二倍比稀释10个浓度梯度，依次接种于己经长好细胞的96孔板中，并设4个复孔、细胞对照孔和空白对照孔，置37 ℃、5% CO₂病毒培养箱中培养，倒置显微镜下观察，细胞出现90%病变时终止培养，按照“2.4.2”项中Cell Counting Kit-8试剂盒操作，测定吸光度A值。应用Reed-Muench公式计算药物半数中毒浓度TC₅₀，并确定最大无毒浓度TC₀，结果见表 2。TC₅₀=[Antilog（log高于50%CPE百分率病毒稀释度+比距）]×C₁（C₁为第1孔药物浓度），TC₀＝细胞存活率在90%以上的最大药物浓度。

2.6 金樱子抗病毒实验 2.6.1 金樱子对病毒直接杀灭作用

不同溶剂萃取物的供试品溶液从无毒浓度起，用2%维持液按二倍比稀释10个浓度梯度，与等体积100倍TCID₅₀的病毒液相互作用2 h，每孔100 μL依次接种于长成单层细胞的96孔板中，并设4个复孔、细胞对照孔、阳性对照孔和空白对照孔，置37 ℃、5% CO₂病毒培养箱中培养，倒置显微镜下观察，细胞出现90%病变时终止培养，按照“2.4.2”项中CCK-8剂盒操作，测定吸光度A，计算细胞存活率，应用Reed-Muench公式计算药物半数有效浓度（EC₅₀）和治疗指数（TI），结果见表 3。EC₅₀=[Antilog（log高于50%CPE百分率病毒稀释度的值-比距）]×C₂（C₂为第1孔药物浓度），治疗指数（TI）=半数毒性浓度（TC₅₀）/半数有效浓度（EC₅₀）。

2.6.2 金樱子对病毒预防作用

不同溶剂萃取物的供试品溶液从无毒浓度起，用2%维持液按二倍比稀释10个浓度梯度，每孔100 μL依次接种于己经长好细胞的96孔板中，2 h后，用PBS清洗，每孔再加入100 μL 100倍TCID₅₀的病毒液，其余实验步骤同“2.6.1”项，计算药物EC₅₀和TI，结果见表 4。

2.6.3 金樱子对病毒穿入细胞后的阻断作用

长成单层细胞的96孔板中每孔加入100 μL 100倍TCID₅₀的病毒液，2 h后，用PBS清洗，不同溶剂萃取物的供试品溶液从无毒浓度起，用2%维持液按二倍比稀释10个浓度梯度，每孔100 μL接种，其余实验步骤同“2.6.1”项，计算EC₅₀和TI，结果见表 5。

3 实验结果及讨论 3.1 实验结果

实验表明，金樱子对RSV、HSV-1、COX-B5、EV71均无预防作用和穿入后的抑制作用，对RSV、HSV-1、COX-B5有直接杀灭作用，对EV71无直接杀灭作用（TI > 4，有杀灭作用）。乙酸乙酯萃取物对RSV直接杀灭作用较好，其TI值为19.333，较阳性对照药利巴韦林（TI值为19.760）效果相差不大；正丁醇萃取物对COX-B5有直接杀灭作用，其TI值为16.622，较阳性对照药利巴韦林（TI值为17.562）效果差；醇提取物对HSV-1效果最好，其TI值为18.922，较阳性对照药阿昔洛韦（TI值为23.742，）效果差。

3.2 讨论

临床上常把利巴韦林作为抗RSV药物，近年来对其疗效争议较大，其治疗结果存在副作用，最显著的是贫血^[17]，而中药抗病毒作用具有多组分，多靶点，副作用小等特点，相比化学药和生物疫苗，中药对各类病毒感染的预防和治疗具有独特的药物作用优势。本实验研究结果表明，中药金樱子乙酸乙酯萃取部位抗RSV效果与利巴韦林相差不大，因此，金樱子在开发新型抗病毒药物上显得尤为重要。我国巨大的天然药物资源，是一笔宝贵的财富，天然药物在抗病毒等领域有着巨大的潜力和优势，具有较大的开发价值。

中药金樱子乙酸乙酯萃取物抗RSV效果较好，乙酸乙酯萃取物含有2α，3β，19α-三羟基齐墩果酸、山奈酚、翻白叶苷A、胡萝卜苷、金樱子皂苷A、野鸦春酸、2α-羟基乌苏酸等化学成分^[18-20]。但其抗病毒物质基础尚不明确，接下来的研究工作应该对中药金樱子乙酸乙酯萃取物进行进一步分离纯化，找到针对RSV有效的1种或几种成分，对中药金樱子抗病毒作用进行精准阐述，在此基础上形成严谨科学的中药材抗病毒研究思路，加强对其他传统中药的抗病毒物质基础和作用机制研究，为建立中药材抗病毒平台奠定一定的基础。