2017, Vol. 37 
2. 沧州医学高等专科学校, 沧州 061001
2. Cangzhou Medical College, Cangzhou 061001, China
山楂叶为蔷薇科山楂属植物山里红Grataegus pinnatifida Bge. var. major N. E. Br.或山楂Grataegus pinnatifida Bge.的干燥叶[1], 多产于我国北部, 野生资源丰富, 是一种常用天然药用植物。山楂叶主要含有黄酮类、有机酸类和一些微量元素, 具有活血化瘀、理气通脉、化脂降浊之功效[2-5]。
近年来, 采用HPLC-UV测定山楂叶中1个或多个黄酮成分[6-10]时有报道, 但该法必须在有对照品的情况下才能进行定性和定量分析, 据此所建立的山楂叶质量控制方法只能针对牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷等紫外吸收较强, 含量较高的成分进行测定, 对于山楂叶中的表儿茶素、山楂叶苷A等紫外吸收较弱的成分进行测定比较困难。
液质联用(LC-MS)是目前应用广泛的分析技术之一, 它将LC的高分离能力与MS的强大结构测定功能相结合, 为中药化学成分的快速分析提供了一个重要的新技术[11-15]。对于一些微量、痕量成分和紫外吸收弱的化合物, 用HPLC-UV分析可能找不到, 而MS具有较高的灵敏度, 很容易检测这些化合物。
本研究采用HPLC-DAD/ESI-MS联用技术, 对山楂叶中表儿茶素、绿原酸、牡荆素、金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、芦丁、山楂叶苷A 8种化学成分进行鉴定和含量测定, 该法专属性强, 操作简便, 灵敏度高, 尤其增加了紫外吸收弱、不宜HPLC-UV检测的表儿茶素和山楂叶苷A的测定, 为提高山楂叶质量、增加检测指标提供了一种简单、高效的分析方法。
1 仪器、试剂与试药Agilent 1200 Series高效液相色谱仪, 6310型质谱仪(Agilent公司)；Poroshell 120 SB-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm 2.7 μm；填料:多孔层十八烷基硅烷键合硅胶；Agilent公司), AG-245型十万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-700型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
对照品表儿茶素(批号151107)、绿原酸(批号120416)、牡荆素(批号111009)、金丝桃苷(批号120105)、牡荆素鼠李糖苷(批号151024)、牡荆素葡萄糖苷(批号151103)、芦丁(批号120221)纯度均 > 98%, 均购于上海融禾医药科技有限公司, 山楂叶苷A(实验室自制, 纯度 > 98%)；甲醇、乙腈为色谱纯, 哇哈哈纯净水, 其他试剂为分析纯。
10个产地33批山楂叶收集产地:河北(S1~S15)、山东(S16~S20)、辽宁(S21)、湖北(S22)、河南(S23~S24)、江苏(S25~S26)、四川(S27)、山西(S28~S30)、浙江(S31)、安徽(S32-S33), 经承德民族师范学院董建新教授鉴定为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge. var. major N. E. Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥叶。
2 方法与结果 2.1 测定条件色谱条件:采用Poroshell 120 SB-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm 2.7 μm), 以0.1%甲酸水为流动相A, 乙腈为流动相B, 梯度洗脱(0~10 min, 10%B→18%B；10~25 min, 18%B→20%B；25~35 min, 20%B；35~40 min, 20%B→60%B；40~41 min, 60%B→90%B；41~50 min, 90%B), 流速0.15 mL·min-1, 检测波长320 nm, 柱温30 ℃, 进样量1 μL。
质谱条件:采用大气压电喷雾离子源(ESI), 负离子扫描, 采用多反应监测(MRM)模式(参数见表 1), 毛细管电压+3.750 kV, 毛细管出口电压-180.0 V, 扫描范围m/z 100~700, 氮气压力1.38×105 Pa, 干燥气流速12.0 L·min-1, 干燥气温度350 ℃。各对照品提取离子流色谱图见图 1, 样品(S8)总离子流色谱图见图 2。
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表 1 8个化合物MRM模式参数 Table 1 The parameters of 8 compounds in MRM mode |
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图 1 8个对照品多反应监测提取离子流图 Figure 1 Multiple reaction monitoring(MRM)chromatograms of 8 standards |
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1.表儿茶素（epicatechin）2.绿原酸（chlrogenic acid）3.牡荆素（vitexin）4.金丝桃苷（hyperoside）5.牡荆素鼠李糖苷（vitexin-rhamnoside）6.牡荆素葡萄糖苷（vitexin-glucoside）7.芦丁（rutin）8.山楂叶苷A（shanyenoside A） 图 2 样品（S8）负离子模式总离子流图 Figure 2 The TIC of sample 8 in negative mode |
精密称取各对照品适量, 分别用甲醇制得含表儿茶素0.023 mg·mL-1, 绿原酸0.022 mg·mL-1, 牡荆素0.011 mg·mL-1, 金丝桃苷0.020 mg·mL-1, 牡荆素鼠李糖苷0.142 mg·mL-1, 牡荆素葡萄糖苷0.074 mg·mL-1, 芦丁0.033 mg·mL-1, 山楂叶苷A 0.020 mg·mL-1的单一对照品储备液, 使用时用甲醇稀释成不同浓度梯度的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液取山楂叶药材粉末(过60目筛)约0.5 g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入60%甲醇水溶液25 mL, 称量, 超声(700 W, 40 kHz)提取30 min, 取出放冷至室温, 再称量, 用60%甲醇水溶液补足损失的量, 摇匀, 提取液于12 000 r·min-1离心10 min, 0.20 μm微孔滤膜过滤, 取续滤液, 即得。
2.3 方法学考察 2.3.1 线性关系考察及检测限、定量限测定按“2.2.1”项下方法, 制备各对照品溶液作为1号溶液, 倍比稀释, 制得单一对照品系列浓度溶液2、3、4、5、6号溶液。分别按“2.1”项下条件进样测定峰面积, 以浓度X为横坐标, 峰面积Y为纵坐标进行线性回归, 分别以S/N=3及S/N=10求得各组分的检测限及定量限, 结果见表 2。
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表 2 8个化合物的回归方程、线性范围和LOD、LOQ Table 2 Regression equations, linear ranges, LOD and LOQ of 8 compounds |
精密吸取表儿茶素5.75 μg·mL-1、绿原酸5.5 μg·mL-1、牡荆素2.75 μg·mL-1、金丝桃苷5. 00 μg·mL-1、牡荆素鼠李糖苷35.5 μg·mL-1、牡荆素葡萄糖苷18.5 μg·mL-1、芦丁8.25 μg·mL-1、山楂叶苷A 5.00 μg·mL-1的对照品溶液各1 μL, 按“2.1”项下分析条件, 分别连续进样6次, 测定各个离子对峰面积, 计算表儿茶素、绿原酸、牡荆素、金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、芦丁、山楂叶苷A的RSD均低于2.7%, 表明精密度良好。
2.3.3 稳定性试验取河北省山楂叶(S8)的供试品溶液, 按“2.1”项下分析条件分别在0、4、8、12、24、48 h进样测定, 结果表儿茶素、绿原酸、牡荆素、金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、芦丁、山楂叶苷A峰面积的RSD均低于2.5%, 说明供试品溶液在48 h内稳定性良好。
2.3.4 重复性试验取河北省山楂叶(S8)6份, 每份约0.5 g, 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液, 按“2.1”项下分析条件进行测定, 结果表儿茶素、绿原酸、牡荆素、金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、芦丁、山楂叶苷A含量的平均值分别为0.09、1.39、1.39、0.36、2.60、0.65、0.20、0.07 mg·g-1, RSD均低于2.3%, 表明试验重复性良好。
2.3.5 加样回收率试验取已知含量的河北省山楂叶(S8)6份, 每份约0.25 g, 精密称定, 分别精密加入对照品表儿茶素、绿原酸、牡荆素、金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、芦丁、山楂叶苷A相当于0.25 g山楂叶所含的量, 按“2.2.2”项下方法制备供试溶液, 按“2.1”项下分析条件测定, 计算表儿茶素、绿原酸、牡荆素、金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、芦丁、山楂叶苷A的回收率分别为101.7%、99.41%、96.20%、99.56%、101.3%、103.8%, 99.82%、100.2%, RSD分别为0.89%、2.6%、2.4%、2.7%, 1.5%、1.8%、1.6%、1.5%。
2.4 样品测定取33批山楂叶样品, 照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液, 照“2.1”项下分析条件进行测定, 并作随行标准曲线计算, 测定结果见表 3。
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表 3 33批样品含量测定结果(mg·g-1, n=3) Table 3 Results of the determination of 33 samples |
前期采用HPLC-UV同时测定了绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、芦丁、金丝桃苷6个成分的含量, 但表儿茶素和山楂叶苷A紫外吸收弱, 用HPLC-UV很难检测到, 采用HPLC-MS/MS法, MRM检测模式, 既可以增加检测灵敏度, 又可以增加检测指标, 实现了待测化合物的准确定量。
3.2 质谱条件优化遵循化合物的裂解规律, 优化质谱条件, 通过对照品筛选出子母离子的质荷比、MRM模式下最优的毛细管电压、毛细管出口电压、碰撞电压等参数。
3.3 含量比较分析本实验对10个产地33批山楂叶进行了8个成分的含量测定, 其中以河北省、山东省为主, 发现8个成分含量差别较大, 河北产山楂叶中8个成分含量范围分别为0.00~0.94、0.39~4.95、0.00~2.41、0.10~2.93、0.03~6.36、0.01~3.95、0.00~4.41、0.01~0.44 mg·g-1；山东产山楂叶中8个成分含量范围分别为0.00~0.85、1.15~2.91、0.00~5.45、0.29~2.23、0.16~3.81、0.03~0.84、0.02~1.02、0.00~0.35 mg·g-1；33批样品中表儿茶素、牡荆素、芦丁和山楂叶苷A在部分样品中检测不到, 而绿原酸、金丝桃苷、牡荆素葡萄糖苷和牡荆素鼠李糖苷为山楂叶主要成分, 在各样品中均能检测到, 但有较大差别, 可能与各地域条件、品种有关。
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