2017, Vol. 37 
曲安奈德是一种合成的肾上腺皮质类激素药物，属于糖皮质激素。其治疗量主要起抗炎和抗过敏作用，临床上用于过敏性疾病、皮肤和结缔组织疾病、骨关节-软组织疾病、眼科非特异性炎症及免疫性疾病和脑外伤；临床上的给药方式为肌肉注射、关节腔内注射和患处皮内注射[1-2]。曲安奈德注射液收载于中国药典2015年版二部，是由曲安奈德原料药与适宜的符合注射用质量要求的辅料制成的混悬型注射液[3]。粒度检查是评价曲安奈德注射液安全性和有效性的重要项目之一，是混悬制剂的生产工艺和质量控制的关键项目；该品种项下粒度检查测定采用显微镜法。
激光散射法是测量粒度中较为常用的一种方法，优点是测试精度高测量速度快、重复性好，测量范围为0.02 µm~3 500 µm。该法广泛用于河流海洋工程、材料学研究、工业粉体研究等粒度的研究[4-6]；而在药品领域中粒度测试应用不广泛[7-11]。本文建立了激光散射法测定曲安奈德注射液的粒度的方法并进行方法学研究，结果表明本法测定速度快，耐用性和重现性较好，适用于曲安奈德注射液的粒度检查。
1 仪器与试药Mastersizer 2000激光粒度分析仪（Malvern），Mastersizer 2000工作站（Malvern），HYDRO 2000SM进样器（Malvern）；奥林巴斯显微镜（BX60），QIMAGING专业显微成像系统；Elma水浴超声仪（功率200 W，频率37 kHz）水为经0.22 µm滤膜过滤的一级水。样品为曲安奈德注射液（Laboratorio Italiano Biochimico Pharmaceutico Lisapharma S.P.A.），批号（60102，60103，60104，60105，60106，60108），聚山梨酯80（广州化学试剂厂，化学纯，20150201-1），十二烷基硫酸钠（以下简称SDS-Na）（广州南方化玻公司进口分装，化学纯，20160725），磷酸二氢钠（广州化学试剂厂，分析纯，20140401-1），油酸钠（德国利保益，药用级，520400-2140525-01）。
2 试剂和供试品制备 2.1 试剂溶液Ⅰ：称取磷酸二氢钠20 g，加入200 mL水，搅拌，超声（功率200 W，频率37 kHz），0.45 µm滤膜过滤；溶液Ⅱ：称取聚山梨酯80 2 g，加入500 mL水，轻轻搅拌，超声，0.45 µm滤膜过滤；
2.2 供试品取3支样品（样品批号为60102）混合后，称取0.25 g至100 mL烧杯中，加溶液Ⅰ 5 mL、溶液Ⅱ10 mL，搅拌均匀，超声（200 W，37 kHz）10 min，超声过程中间隔2~3 min，并搅拌均匀样品；再加溶液Ⅰ 5 mL、溶液Ⅱ50 mL，轻轻搅拌，小心混匀，避免产生泡沫。
3 方法的优化 3.1 激光粒度仪的参数设置背景及样品的扫描时间为15 s，搅拌速率为850 r·min-1；分散液为水；分散助剂为聚山梨酯80和磷酸二氢钠，颗粒折射率为1.50；颗粒吸收率为0.001；遮光度为5% ~ 15%。
3.2 样品分散液曲安奈德在在水中极微溶解[3]，因此可以水为分散液。
3.3 分散助剂的考察经显微镜下观察曲安奈德注射液的混悬粒子的状态，其颗粒成絮凝状态，采用激光粒度法湿法测定粒度时需确保被测粒子为单独分散的颗粒[14]；采用显微镜观察三组不同分散助剂SDS-Na/磷酸二氢钠、聚山梨酯80/磷酸二氢钠、油酸钠（磷酸二氢钠与油酸钠混合时生成油酸不溶物，因而考察油酸钠单独使用的情况）对样品颗粒的分散效果，以及观察分散体系产生气泡的情况。其中SDS-Na和油酸钠均为阴离子表面活性剂其分散原理为表面离子化和空间稳定作用，聚山梨酯80为非离子表面活性剂其分散原理为空间稳定作用，磷酸二氢钠属离子化合物其分散原理为空间稳定作用。结果显示，使用SDS-Na/磷酸二氢钠分散的样品极易产生泡沫，且泡沫细小，且放置2 h以上泡沫无法消除，显微镜下观察样品颗粒基本分散；使用聚山梨酯80/磷酸二氢钠分散的样品产生的泡沫放置10 min即可消除，镜检观察颗粒全部分散；使用油酸钠作为分散助剂，样品完全溶解，无法继续测试。根据样品分散和起泡性的结果，聚山梨酯80/磷酸二氢钠混合使用的分散效果较好。
通过对聚山梨酯80浓度为0.1%、0.2%、0.4%、0.8%的考察（磷酸二氢钠溶液的浓度不变），考察测试体系的外观、是否有气泡、显微镜检查颗粒的分散程度，结果表明0.4%的聚山梨酯80与磷酸二氢钠混合使用，颗粒分散最好无团聚，测试溶液的气泡少，符合激光粒度法测试要求。
聚山梨酯80作为非离子表面活性剂，具有增溶、降低表面张力、增加亲水性的作用[12]。经考察[13]，曲安奈德在0.4%聚山梨酯80溶液中几乎不溶。
3.4 光学参数的考察激光粒度测试分为湿法和干法测定，湿法测定中需要设定的光学参数有测试介质折射率、样品折射率和样品吸收率3个参数，其中测试介质为水（折射率为1.33），考察样品折射率1.40、1.45、1.50、1.55 4个水平，样品吸收率分别考察0、0.001、0.01、0.1 4个水平。以结果残差和加权残差均满足小于1%的条件，结合样品在显微镜下呈透明晶体的形态，选择吸收率0.001和折射率1.50为光学参数。
3.5 分散条件的考察激光粒度法在粒度测试过程中最为关键的是测试样品的代表性和样品的分散程度，其决定了测试结果的准确度和重复性[14-15]。按照“2.2”制备样品，分别考察样品制备过程中的超声时间（5 min、10 min、15 min），搅拌速度（850 r·min-1、1000 r·min-1、1 200 r·min-1）以及样品浓度（遮光度5%，10%，15%）3个重要参数对粒度结果的影响。结果表明超声5 min的测试结果精密度不能满足RSD小于6%的要求，10 min和15 min超声时间可使样品分散达到稳定状态；由于测试体系中含有表面活性剂类的分散助剂，在样品制备及测试过程中易产生泡沫引起测定结果的偏差，转速1 200 r·min-1的测试结果检测到气泡，因此在满足测试精密度和残差小于1%的条件下，选择低转速850 r·min-1；样品浓度由遮光度体现，遮光度在5%~15%范围的测试结果精密度、残差和粒度及其分布的结果一致，因此遮光度选择为5%~15%。各参数条件下测试5次，结果见表 1。
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表 1 分散条件、光学参数对粒度测定的考察（n=5） Table 1 Investigation results of sample dispersing condition and optical parameters |
按“2.2”处理样品，在测试条件下在2 h内重复测定多次，考察遮光度、粒度及其分布、残差的变化；结果发现上述3个参数均没有发生显著变化，d（0.1）、d（0.5）、d（0.9）、D[4, 3]和遮光度的RSD均小于6%。说明样品经处理后2h内稳定，未出现团聚现象。
3.7 精密度考察 3.7.1 日内精密度按“2.2”处理样品，各测试5次。统计测定结果的粒度分布数据和粒度结果，进行分析比较并计算RSD（n=5），平均值结果为d（0.1）为2.975 µm，d（0.5）为4.725 µm，d（0.9）为7.688 µm，D[4, 3]为5.076 µm；RSD分别为4.2%，4.0%，3.9%，3.9%，均小于6%，符合要求。
3.7.2 日间精密度按“2.2”处理样品，连续测定3 d；统计测定结果的粒度分布数据和粒度结果，进行分析比较并计算RSD（n=3），平均值结果为d（0.1）为2.960 µm，d（0.5）为4.668 µm，d（0.9）为7.538 µm，D[4, 3]为5.005 µm；RSD分别为2.5%、2.5%、2.5%、2.5%，均小于6%，符合要求。
3.8 样品测试结果取6批经按中国药典方法检验合格的曲安奈德注射剂产品，分别按“2.2”处理样品测试，记录样品体积累计结果d（0.1）、d（0.5）、d（0.9）、D[4, 3]及残差；采用工作站粒度分级功能，分别列出样品中小于5 µm、6 µm、7 µm、8 µm、10 µm和15 µm的计数累计百分数结果；其中小于5 µm的体积累计百分数为50%~58%，小于10 µm的体积累计百分数为95%~98%，各批次的粒度数据结果见表 2。
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表 2 激光粒度仪和显微镜测试样品的结果 Table 2 Results of particle size distribution by laser scattering analyzer and microscope |
激光散射法的测试原理是单色光束照射到颗粒供试品后发生散射现象，由于散射光能量分布与颗粒大小相关，因此通过测量散射光的能量分布，依据米氏散射理论和弗朗霍夫理论计算出颗粒的粒度分布[14]；其粒度结果是通过计算拟合后得到的数据，并不是待测物质的真实颗粒直径；其粒度分布结果是以拟合后得到的体积比与粒径之间的关系来表示。鉴于曲安奈德注射液属于混悬注射剂，优先采用湿法分散测定样品的粒度及其粒度分布。根据湿法分散液选择的原则[14]，水作为测试分散液具有环保安全，被测物在水中不溶解、透明、粘度较低等特点，可以作为曲安奈德注射液的测试分散液。
4.2 样品分散条件的优选激光散射法测定的技术不能分辨所测定的样品是单一粒子还是团聚的粒子，因此样品分散的有效性是激光粒度测定方法中影响测试结果的最重要因素之一。曲安奈德注射液属于混悬剂，具有混悬剂物理化学的特殊性—絮凝，其未经前处理的样品在显微镜下观察颗粒均呈团聚现象；为能获得单一粒子的供试品，分别对分散助剂、超声时间、测试转速3个分散条件进行考察。分散助剂中加入磷酸二氢钠可以使颗粒表面离子化，表面电位Zeta电位达到30 mV以上，使分散体系更加稳定；加入聚山梨酯80能够显著降低曲安奈德颗粒和分散液之间的界面张力并吸附在曲安奈德颗粒表面形成空间稳定的作用。机械能外力打开测试体系团块效应的方法有研磨、搅拌、超声，其中超声波比研磨和搅拌打开团块所使用的摩擦力小，为实验室制备分散体系的首选方法。
4.3 激光散射法与显微镜法结果比较对曲安奈德注射液6个批次的样品测试结果显示，小于5 µm的体积累计百分数为50% ~ 58%，小于10 µm的体积累计百分数为95% ~ 98%，与中国药典项下的要求有所不同，药典标准要求颗粒均应小于15 µm，其中5 µm以下的颗粒不得少于70%，10 µm以下的颗粒不得少于97%[3]。主要原因是中国药典显微镜法的结果表述采用计数百分比，激光散射法结果表述采用体积累积百分比，由于测定的原理和表述的方式均有不同[16]，因此在满足临床安全性颗粒均应小于15 µm要求的前提下，在激光散射法测定粒度及其分布结果的基础上，如何评价产品质量可在今后的研究中再探讨。
对粒度测试结果的准确度和精密度影响最大的因素是样品代表性和样品分散效果，其次是测量方法原理不同以及测试方法不同带入的系统误差。中国药典2015年版二部中收载曲安奈德注射液及进口药品标准均采用显微镜法对粒度进行检查，显微镜法测试取样量按方法项下取样量为1滴，需观测3个视野或至少600个粒子，其取样代表性、肉眼观测大量颗粒和肉眼测量精度三方面对测试结果均会造成较大的影响。激光散射法与显微镜法相比取样更具代表性，测试速度快，不受检测人员的主观肉眼观察因素影响，适合作为曲安奈德注射剂（混悬液）的粒度及粒度分布的测定方法。
| [1] |
汤光. 曲安奈德混悬剂注射液[J]. 中国医院药学杂志, 2002, 22(12): 770. TANG G. Triamcinolone acetonide injection[J]. Chin J Hosp Pharm, 2002, 22(12): 770. |
| [2] |
郭敏, 刘宏, 季可非, 等. 曲安奈德局部给药制剂的研究进展[J]. 中国药师, 2016, 19(3): 559. GUO M, LIU H, JI KF, et al. Advances in local administration preparations of triamcinolone acetonide[J]. China Pharm, 2016, 19(3): 559. |
| [3] |
中国药典2015年版. 二部[S]. 2015: 361 ChP 2015.VolⅡ[S].2015:361 |
| [4] |
范北林, 闵凤阳, 黎礼刚, 等. 几种模型沙激光粒度仪测试结果与筛析-沉降法的比较[J]. 长江科学院院报, 2009, 26(12): 6. FAN BL, MIN FY, LI LG, et al. Comparison between grain sizes measured by laser diffract instrument and sieve-pipette methods for several model sediments[J]. J Yangtze River Sci Res Ins, 2009, 26(12): 6. DOI:10.3969/j.issn.1001-5485.2009.12.002 |
| [5] |
谭立新, 余志明, 蔡一湘. 激光粒度法测试结果与库尔特法、沉降法的比较[J]. 中国粉体技术, 2009, 15(3): 60. TAN LX, YU ZM, CAI YX. Measurement results comparison between laser particle analyzer, coulter counter and pipette methods[J]. China Powder Sci Technoly, 2009, 15(3): 60. |
| [6] |
舒霞, 吴玉程, 程继贵, 等. Mastersizer 2000激光粒度分析仪及其应用[J]. 合肥工业大学学报, 2007, 30(2): 164. SHU X, WU YC, CHENG JG, et al. Mastersizer 2000 laser particle size analyzer and its applications[J]. J Hefei Univ Technol, 2007, 30(2): 164. |
| [7] |
谷广智, 王也牧, 刘蔚, 等. 依非韦伦原料药的激光散射法测定[J]. 中国医药工业杂志, 2016, 47(1): 67. GU GZ, WANG YM, LIU W, et al. Determination of efavirenz particle size by laser light scattering method[J]. Chin J Pharm, 2016, 47(1): 67. |
| [8] |
狄天云, 高原雨, 朱捷, 等. 激光粒度仪测定醋酸肤轻松乳膏粒度的方法学研究[J]. 药物分析杂志, 2016, 36(1): 181. DI TY, GAO YY, ZHU J, et al. Methodological study of particle size of fluocinonide cream by laser particle analyzer[J]. Chin J Pharm Anal, 2016, 36(1): 181. |
| [9] |
李文凯, 吴玉新, 黄志民, 等. 激光粒度分析和筛分法测粒径分布的比较[J]. 中国粉体技术, 2007, 13(5): 10. LI WK, WU YX, HUANG ZM, et al. Measurement results comparison between laser particle analyzer and sieving method in particle size distribution[J]. China Powder Sci Technol, 2007, 13(5): 10. |
| [10] |
邹文博, 许铭哲, 王晨, 等. 激光散射法测定的乳糖的粒度[J]. 药物分析杂志, 2007, 27(9): 1420. ZOU WB, XU MZ, WANG C, et al. Measurement of particles size distribution of lactose by laser light scattering method[J]. Chin J Pharm Anal, 2007, 27(9): 1420. |
| [11] |
陈祝康, 陈桂良, 李惠义. 药物及其制剂粒度测定法的探讨[J]. 中国药品标准, 2012, 13(6): 405. CHEN ZK, CHEN GL, LI HY. Discussion about particle size analysis of drug and pharmaceuticals[J]. Drug Stand China, 2012, 13(6): 405. |
| [12] |
谢守霞, 李高. 复方曲安奈德混悬型注射液的处方优化及物理稳定性考察[J]. 中国医院药学杂志, 2003, 23(9): 534. XIE SX, LI G. Optimization of prescription for triamcinonide compound injection by orthogonal design method and investigation of physical stability[J]. Chin Hosp Pharm J, 2003, 23(9): 534. |
| [13] |
中国药典2015年版. 二部[S]. 2015: XⅢ ChP 2015.VolⅡ[S].2015:XⅢ |
| [14] |
GB/T 19077. 1-2008粒度分析激光衍射法第1部分: 通则[S]. 2008 GB/T 19077.1-2008 Particle Size Analysis-Laser Diffraction Methods-Part 1:General Principles[S].2008 |
| [15] |
GB/T 20099-2006样品制备粉末在液体中的分散方法[S]. 2006 GB/T 20099-2006 Sample Preparation-Dispersing Procedures for Powders in Liquids[S].2006 |
| [16] |
谭立新, 蔡一湘, 余志明, 等. 各种粒度表征技术的相关性研究[J]. 材料研究与应用, 2011, 5(1): 57. TAN LX, CAI YX, YU ZM, et al. Research of the technology on different characterization of particle size[J]. Mater Res Appl, 2011, 5(1): 57. |