2017, Vol. 37 
2. 浙江工业大学药学院, 杭州 310014;
3. 金华市食品药品检验检测研究院, 金华 321000
3. Jinhua Institute for Food and Drug Control, Jinhua 321000, China
近年来毒品滥用问题持续蔓延，吸食甲基苯丙胺、氯胺酮和海洛因等毒品造成了严重的社会危害，如导致犯罪率高发，带来经济损失，严重影响身心健康等[1-2]。准确掌握毒品的滥用种类、滥用量、滥用模式、滥用趋势等重要信息对于开展禁毒工作具有重要意义，然而如何准确评估毒品的滥用量是禁毒领域的研究难题。2001年Daughton提出了基于污水分析法评估毒品滥用情况的设想，该方法基于毒品吸食代谢后通过下水管道排入城市污水处理系统的原理，设想通过检测污水处理厂污水中毒品代谢物的浓度，结合污水流量、毒品代谢率、社区人口数等数据评估社区范围内毒品的滥用情况[3]。2005年Zuccato等在意大利成功地利用污水分析法评估了社区可卡因的滥用情况[4]。由于污水分析法具有客观、实时等优点[5]，污水分析法引发了药学、环境科学和流行病学等研究人员的广泛研究兴趣[6-12]。准确地测定水体中毒品代谢物的浓度是污水分析法评估毒品滥用量的关键。我国学者谢普等研究了UPLC-MS/MS法测定吸毒者头发中10种毒品代谢物含量的方法[13]，但水体中毒品代谢物含量测定方法的研究未见报道。本研究建立一种基于固相萃取UPLC-MS/MS同时测定水体中甲基苯丙胺、氯胺酮和海洛因3种毒品代谢物浓度的方法，该方法为污水分析法评估毒品滥用量提供了重要的分析手段。
1 仪器和试药 1.1 仪器ACCQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱仪（Waters公司）；Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪（Waters公司）；ACCQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Waters公司）。Eppendorf 5424型离心机（Eppendorf公司）；H-101多功能漩涡混合器（上海康禾光电仪器有限公司）；Sartorius MSE125P-100-DA分析天平（赛多利斯集团）；BYCQ-24D固相萃取仪（上海秉越电子仪器有限公司）；Evaporex EVX-192氮吹仪（Apaicot Designs公司）；Millipore超纯水仪（Millipore公司）；Oasia HLB固相萃取小柱（60 mg/3 mL，Waters公司），Oasia MCX固相萃取小柱（60 mg/3 mL，Waters公司）。
1.2 药品和试剂甲基苯丙胺对照品溶液（批号FE02201501，浓度1.0 mg·mL-1）、甲基苯丙胺-D5内标物溶液（批号FE09091502，浓度100 μg·mL-1）、氯胺酮对照品溶液（批号FE01131504，浓度1.0 mg·mL-1）、氯胺酮-D4内标物溶液（批号FE03311501，浓度100 μg·mL-1）、6-乙酰吗啡对照品溶液（批号FE07141402，浓度1.0 mg·mL-1）及6-乙酰吗啡-D3内标物溶液（批号FE07211505，浓度100 μg·mL-1），美国Cerilliant公司；甲醇、甲酸、乙腈、醋酸铵均为色谱纯，水为自制超纯水。
2 试验方法 2.1 色谱-质谱条件 2.1.1 色谱条件采用ACCQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，以0.01%甲酸-5 mmol·L-1醋酸铵（A）-甲醇（B）为流动相，梯度洗脱（0~3.0 min，90%A→10%A；3.0~3.6 min，10%A→90%A；3.6~6.0 min，90%A→10%A），流速0.3 mL·min-1，柱温40 ℃，进样量3 μL。
2.1.2 质谱条件采用电喷雾离子化（ESI），正离子扫描模式；毛细管电压1.00 kV；脱溶剂气和锥孔气为氮气，脱溶剂温度为400 ℃，脱溶剂气流速为800 L·h-1；采用多反应监测模式检测；定量定性检测离子对及锥孔电压等参数见表 1。
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表 1 毒品代谢物和内标主要MRM参数 Table 1 MRM parameters of drug metabolites and the internal standards |
在上述条件下，甲基苯丙胺、氯胺酮和6-乙酰吗啡出峰时间分别为1.63、1.86和1.43 min，内标甲基苯丙胺-D5、氯胺酮-D4及6-乙酰吗啡-D3出峰时间为1.62、1.85和1.43 min；甲基苯丙胺、氯胺酮和6-乙酰吗啡和内标色谱峰形均良好，无杂质峰干扰测定，基线平稳，见图 1。
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图 1 分析物和内标物色谱图 Figure 1 Typical chromatograms of analytes and internal standard |
移取甲基苯丙胺对照品溶液、氯胺酮对照品溶液、6-乙酰吗啡对照品溶液适量，分别加甲醇稀释成质量浓度为100 μg·mL-1的溶液；取上述3种溶液各0.5 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得质量浓度为5.0 μg·mL-1的混合对照品储备液；精密移取上述混合对照品储备液1.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得质量浓度为100 ng·mL-1的混合对照品溶液。
2.2.2 混合内标物溶液移取甲基苯丙胺-D5、氯胺酮-D4及6-乙酰吗啡-D3的内标物溶液各0.5 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得质量浓度为5.0 μg·mL-1的混合内标物储备液；精密移取混合内标物储备液1.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得质量浓度为100 ng·mL-1的混合内标物溶液。
2.3 样品前处理 2.3.1 样品的采集和过滤地表水样品9份，分别采自杭州市京杭运河、钱塘江、湘湖；污水处理厂水样15份，分别采自杭州市5个不同的污水处理厂。采集的水样置100 mL棕色玻璃瓶中避光保存，用2 mol·L-1盐酸调节pH至2，水样通过玻璃纤维滤膜（0.45 μm）过滤除去固体颗粒，待固相萃取。
2.3.2 固相萃取Oasis HLB固相萃取小柱（60 mg/3 mL）使用前依次使用6 mL甲醇、6 mL超纯水和6 mL pH 2的超纯水进行活化；取“2.3.1”项下过滤后的水样50 mL，加入混合内标物溶液10 μL，旋涡混匀1 min后上样，上样速度为2 mL·min-1；待样品过柱后用4 mL甲醇和4 mL含有5% NH3的甲醇溶液洗脱，洗脱速度为2 mL·min-1；在水浴35 ℃条件下，用氮气气流进行吹脱至近干，用甲醇-水（1：9）溶解定容至0.4 mL，涡旋混合，即得供试溶液，取3 μL进样。
2.4 方法学考察 2.4.1 标准曲线制备与线性范围取混合对照品溶液适量，用流动相稀释，制得质量浓度分别为0.5、1、2.5、5、10、25 ng·mL-1的标准系列溶液。依次取上述各浓度标准系列溶液50 mL，按照“2.3.2”项下方法操作，记录色谱图；以对照品溶液的峰面积与同位素内标的峰面积之比为纵坐标（Y），进样浓度（X）为横坐标，采用加权（W=1/X2）最小二乘法进行回归运算，得甲基苯丙胺、氯胺酮和6-乙酰吗啡回归方程：
| $ \begin{array}{l} Y = 0.764\;3X + 0.159\;3\;\;r = 0.999\;3\\ Y = 0.495\;6X + 0.046\;60\;\;r = 0.999\;0\\ Y = 0.999\;5X + 0.0034\;69\;\;r = 0.999\;5 \end{array} $ |
结果表明甲基苯丙胺质量浓度在0.5~25 ng·mL-1范围内线性关系良好，氯胺酮和6-乙酰吗啡在0.5~10 ng·mL-1范围内线性关系良好。在最低添加浓度下，当S/N=3时测得甲基苯丙胺、氯胺酮和6-乙酰吗啡检出限均为0.15 ng·mL-1，当S/N=10时测得3种待测物的定量限均为0.5 ng·mL-1。
2.4.2 方法回收率、精密度与准确度试验取混合对照品储备液适量，配制成低、中、高3个浓度（1、5、15 ng·mL-1）的质控样品，分别按“2.3.2”项下方法平行操作；每一浓度进行5样本分析，连续测定3 d，根据当日标准曲线，计算质量样品测定浓度，得出甲基苯丙胺、氯胺酮和6-乙酰吗啡的方法回收率，计算所测浓度的RSD，进行精密度考察，结果见表 2。数据结果表明甲基苯丙胺、氯胺酮和6-乙酰吗啡的回收率、精密度良好。
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表 2 测定水体中甲基苯丙胺、氯胺酮和6-乙酰吗啡的方法回收率、精密度（n=5） Table 2 Method recoveries and precisions of the analysis of methamphetamine, ketamine and 6-acetylmorphine |
取混合对照品储备液适量，配制成低、中、高3个浓度的质控样品各5份，分别按照“2.3.2”项下方法平行操作，记录峰面积。另配制相应浓度的混合对照品溶液，直接进样并记录峰面积。将2种不同处理方法所测得峰面积相比较，计算得出甲基苯丙胺、氯胺酮和6-乙酰吗啡提取回收率分别为93.4%、91.0%和89.5%，RSD分别为5.8%、12.2%和13.6%，表明提取回收率良好。
按“2.4.2”项下方法制得质控样品，考察3种化合物在不同条件下的稳定性。取低、中、高3种浓度质控样品，室温放置6 h、30 d和经3个冷冻-融解循环处置，然后分别按“2.3.2”项下方法平行操作，分析测定化合物的质量浓度，计算RSD。室温放置6 h的RSD（n=5）均小于12.1%，30 d的RSD（n=5）均小于13.7%，3次反复冻融（n=5）RSD均小于14.5%。
2.4.4 基质效应采用标准添加法校正基质效应，将“2.3.2”项下处理的样品平均分成2份，1份直接进样分析，记录待测物和内标的峰面积；另1份根据第1份的检出情况，精密加入各化合物混合对照品溶液适量，然后进样分析，记录待测物和内标的峰面积。依据标准添加法校正公式计算待测物浓度C=SRx/（Rs-Rx），其中C为校正后的浓度；S为标准添加量；Rx为标准添加前测得待测物与内标峰面积比值；Rs为标准液添加后测得待测物与内标峰面积比值。基质效应（ME）表示为同一添加浓度的被分析物在基质中的浓度与分析物在溶液中的浓度的比值，ME=Cm/Cs×100。结果各化合物基质效应（n=5）均在86.1%~97.4%之间，表明本方法甲基苯丙胺、氯胺酮、6-乙酰吗啡以及内标的测定均不受基质效应干扰。
2.5 样品检测结果将本研究建立的固相萃取UPLC-MS/MS法应用于杭州市地表水和污水处理厂采集水样测定。分别于京杭运河、钱塘江、湘湖和杭州市区5个不同污水处理厂各采集3份水样进行检测，并对市售怡宝饮用纯净水进行检测，检测结果如表 3所示。甲基苯丙胺是检出率和浓度最高的毒品，其次是氯胺酮和海洛因，城区毒品代谢物浓度较郊区高。
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表 3 化合物含量检测结果（ng·L-1） Table 3 Testing results of target analytes |
毒品吸食代谢后经下水道进入城市污水管网系统，一部分进入河流、湖泊，大部分最后汇集于污水处理厂。地表水和污水处理厂污水中毒品代谢物的浓度非常低，同时水样成分复杂，因此水样通过固相萃取进行前处理和浓缩是顺利进行UPLC-MS/MS分析测试的关键。
3.2 分析物的选择毒品经体内代谢会产生多种成分，理想的目标分析物是毒品代谢的主要产物且在污水中具有较好的稳定性，易于检测分析。本研究中甲基苯丙胺、氯胺酮的主要代谢产物分别为甲基苯丙胺和氯胺酮，且2种代谢产物在污水中具有较好的稳定性；海洛因的主要代谢产物为吗啡，考虑到临床用药中多种药品使用后均会代谢得到吗啡，本研究中选择海洛因特有的代谢物6-乙酰吗啡作为目标分析物，避免了临床用药的干扰，有利于准确评估海洛因的滥用量。
3.3 同位素内标物的选择本研究共选择了3种同位素内标，在不同的分析时间段，参考不同内标的保留时间，以尽可能地减少待测物保留时间偏移对结果的影响。本实验采用内标对分析过程进行质量控制，确保检测结果的可靠性。
3.4 固相萃取方法的选择实验比较了Oasis HLB固相萃取柱和Oasis MCX固相萃取柱对目标分析物富集净化效果和回收率的影响，结果表明Oasis HLB固相萃取柱富集净化效果较好，总体回收率均大于83%。同时对洗脱溶剂进行优化，结果表明甲醇作为洗脱溶剂6-乙酰吗啡充分洗脱，但甲基苯丙胺和氯胺酮洗脱不完全；5% NH3甲醇作为洗脱溶剂，洗脱现象正好相反。综合考虑，实验采用4 mL甲醇和4 mL含有5% NH3的甲醇溶液洗脱，洗脱速度为2 mL·min-1。
3.5 样品检测结果分析本次检测分别采集了运河、钱塘江、湘湖和不同污水处理厂水样，实验以纯净水作为对照，在连续检测中3种毒品代谢物浓度均低于检测限，在所有水样中均未检出6-乙酰吗啡，京杭大运河和钱塘江中检测到低浓度的甲基苯丙胺和氯胺酮。从检测结果来看，污水处理厂检出甲基苯丙胺的浓度明显高于京杭大运河和钱塘江，检测结果同时表明人口密度大、娱乐场所较多的城市中心污水处理厂-2和污水处理厂-3甲基苯丙胺和氯胺酮浓度明显高于郊区。
4 结论本文建立了固相萃取UPLC-MS/MS法同时测定水体中甲基苯丙胺、氯胺酮和海洛因代谢物浓度，本研究在反复摸索与试验调整中确定了以上固相萃取、色谱与质谱条件，证明该方法具有灵敏度高，操作简便、快速、准确等优点，可以为污水分析法监测毒品滥用量提供重要的分析手段。
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