C-肽（C-peptide，C-P）是在胰腺β细胞内合成的一种单链多肽（分子量3020），含31种氨基酸，在胰岛素原分子内作为连接胰岛素A链和B链的连接肽。前胰岛素经酶裂解转化为胰岛素和C-肽，然后被β细胞等摩尔分泌到血液循环中。C-肽半衰期比胰岛素长，可高浓度存在于外周血液循环中^[1-4]。因此临床上血浆C-肽水平可能是分析胰腺分泌胰岛素能力以及评估残余β细胞功能的一个更可靠指标，并且可用于诊断潜伏性低血糖或胰岛素瘤，以及作为胰腺切除术后残余胰腺组织标记物^[5-11]。

现行人C-肽国际参考试剂（IRR，84/510）建立于1986年，是各种C-肽国家标准品和PRL免疫分析试剂溯源时使用的一级标准品，广泛应用于全世界范围内免疫测定人血清和血浆中C-肽方法的校准。由于存量几乎耗尽，因此在2010年WHO生物标准化专家委员会提出了替换84/510的建议。随后按照WHO相关程序，化学合成并分装制备了人C-肽国际候选标准品（编号为13/146），每瓶含约8 μgC-肽。由于依照当前技术条件，不能直接用理化方法准确定值，因此WHO开展了三期国际协作研究，以质量单位定义该候选品浓度，并分析其免疫反应性。第Ⅰ期建立C-肽主校准品，通过氨基酸分析确定了主校准品C-肽含量为209 μg；第Ⅱ期以主校准品为标准，通过HPCL方法标定13/146的C-肽含量为8.6 μg·安瓿^-1，同时考察热加速降解13/146的稳定性；第Ⅲ期分为Ⅲa和Ⅲb期，Ⅲa期目的是评价常规保存条件下和加速降解的13/146的免疫学活性，以提供可预估13/146稳定性的免疫学分析数据，Ⅲb期分析13/146与人血清、尿液样本之间的互换性。

三期研究共有10个国家24个实验室参与。中国食品药品检定研究院非传染病诊断试剂室代表中国实验室应邀参加了Ⅲa期研究。

1 实验材料 1.1 样本

NIBSC提供的样本：C-肽国际标准品候选品（13/146）：由化学合成的C-肽加入至含0.5%海藻糖的10 mmol·L^-1磷酸盐缓冲液（pH为7.0）制备而成，每支安瓿分装0.5 mL后冻干融封。编号为Assay 1和Assay 2（分别用于2次独立实验中）保存于4、20、37和45 ℃环境下18个月的热加速降解候选品。样本信息见表 1，所有的热加速降解样本均以字母编号。本实验室被分派到C-肽候选标准品13/146。

本实验室提供的样本：C-肽国际参考品（84/510），1.0 mL·安瓿^-1，每安瓿含纯化人胰岛素C-肽提取物10 μg、1 mg无肽酶人血白蛋白、5 mg乳糖的溶液冻干后残余物。

1.2 试剂盒

本次国际协作标定的试剂盒，包括放射免疫法、酶联免疫法、（电）化学发光免疫法和时间分辨免疫荧光法等方法共8种试剂盒，分别为：碘[¹²⁵I]人C-肽放射免疫分析药盒，北京北方生物技术研究所；C-肽定量检测试剂盒（磁微粒分离酶联免疫法），北京倍爱康生物技术有限公司；C-肽测定试剂盒（化学发光法），四川迈克生物科技股份有限公司；C-肽测定试剂盒（化学发光免疫分析法），深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；C-肽测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法），雅培贸易（上海）有限公司；C-肽检测试剂盒（电化学发光法），罗氏诊断产品（上海）有限公司；C-肽测定试剂盒（化学发光法），索灵诊断医疗设备（上海）有限公司；C-肽定量检测试剂盒（时间分辨免疫荧光分析法），广州市达瑞抗体工程技术有限公司，以上试剂均有注册证。

1.3 分析缓冲液

全部试验中采用NIBSC推荐用分析缓冲液（0.01 mol·L^-1磷酸盐缓冲液，含0.1% BSA，pH 7.2~7.4），复溶和稀释样本；部分实验中同时采用各试剂盒专用稀释液稀释样本。

2 WHO对国际协作标定实验的要求 2.1 实验操作

收样后应置于-20 ℃或以下保存。开瓶前，应将样本恢复至室温以减少水分吸收。采用1 mL含0.1%BSA的PBS或其他适当缓冲液溶解安瓿内容物，作为母液。进一步的稀释应采用适当缓冲液或含0.1%BSA的PBS，并确保缓冲液中含一定量蛋白以防止安瓿的吸附作用。母液分装后应置于-20 ℃或以下保存。参加实验室每种方法至少完成2次独立分析，每次独立分析均应包含分配的所有样品；样品每次应采用新开封的13/146或保存于-20 ℃条件下的13/146母液配制每条剂量-反应曲线，每条曲线至少应包含5个核心剂量水平（10、5、2.5、1.25、0.625 ng·mL^-1）。每个水平至少2~3次重复。每支安瓿C-肽浓度的计算应通过试剂盒标准曲线得到。

2.2 实验记录

各参加实验室须提供分析方法的详细情况，包括复溶和稀释步骤以及原始数据（如OD值、RLU等），并以电子版的形式提交给NIBSC中央计算机处理系统。同时须提交本实验室计算得到的各样本C-肽浓度值。

3 实验方法

本次协作标定实验过程中严格按照WHO的要求进行操作。

3.1 样品复溶与系列溶液配制

采用1.0 mL分析缓冲液复溶13/146，得到母液。然后使用分析缓冲液，在各试剂盒的线性范围内，进一步稀释母液，配制至少5个剂量水平（含NIBSC建议的核心浓度）以上的样本，同时增加了对采用试剂专用稀释液配制的各浓度C-肽样本的测定，以资比较。

在对13/146分析的同时，本实验室在部分试剂盒上增加了对84/510的分析，复溶和稀释均采用NIBSC建议缓冲液，配制步骤同13/146。

3.2 剂量-反应曲线制作

各方法的每次独立实验中，至少包括1条13/146以及1条试剂盒校准品的剂量-反应曲线，每条剂量-反应曲线含5~7个剂量水平，每个剂量水平重复测定2~3次。部分试剂盒上还包括1条84/510的剂量-反应曲线，其剂量水平和测定次数同13/146。

3.3 实验操作

所有免疫分析操作均按各试剂盒说明书提供的方法进行。

3.4 数据处理

按照2种方法进行处理。（1）NIBSC要求的处理方法：由各试剂盒标准曲线计算得到13/146实测值。（2）以现行标准品84/510标定候选品13/146的处理方法：放射免疫分析法采用log（dose）-logit（B/B₀）数学模型拟合，其余双抗体夹心法免疫分析用双对数log（dose）-log（cpm/OD/RLU）数学模型拟合。84/510与相应剂量水平的13/146同时进行分析测定，用双对数数学模型拟合，采用t检验分析84/510与13/146的剂量-反应曲线是否平行（平行表明待测样本与标准品为同质样本，方可进行比较）。在平行的前提下，以84/510剂量-反应曲线为标准曲线，计算各样本的实测值与理论值的效价比，最终得到各样本的效价。t检验结果不平行的样本，则不进行效价比的计算。

4 实验结果 4.1 13/146和84/510的测定结果

根据NIBSC要求的处理方法，直接上报按各试剂盒标准曲线得到的数值。由于本实验室提供的放免方法测定值显著低于其他方法，WHO在统计时删去了该数据，结果见表 2。WHO数据摘自《WHO C-肽第1次国际标准品国际协作研究》报告。结果表明：本实验室上报的13/146测定均值为9.98 μg·安瓿^-1，与WHO汇总数据（9.78 μg·安瓿^-1）相对偏差为2.0%；本实验室上报的84/510均值为9.60 μg·安瓿^-1，与WHO汇总数据（9.20 μg·安瓿^-1）相对偏差为4.3%，与理论效价的相对偏差为-4.1%。84/510的全部数据中，4/6的数据与理论值（10 μg·安瓿^-1）相对偏差在±10.0%范围内。

4.2 以84/510计算13/146的测定结果

根据“3.4”中第2种数据处理方法，本实验室以现行C-肽国际参考品84/510为标准标定13/146，得到不同免疫分析方法测定值，结果见表 3。数据表明，以84/510为标准标定得到的13/146均值（10.24 μg·安瓿^-1）比直接通过各试剂盒测定得到的均值（9.98 μg·安瓿^-1）高2.6%，比WHO汇总数据（9.20 μg·安瓿^-1）高11.3%。

4.3 不同缓冲液对13/146测值影响的分析结果

本实验室同时进行了采用不同分析缓冲液配制13/146对测值影响的分析，结果见表 4。结果表明，采用NIBSC推荐缓冲液（含0.1%BSA的PBS缓冲液）配制13/146，测定值大部分低于采用专用缓冲液配制的13/146测定值，但相对偏差尚在±10.0%范围内，仅一家试剂测定结果偏高，且相对偏差大于10.0%。

5 结论

WHO统计组将Ⅱ期HPLC测得数据汇总分析，作为最终C-肽定值数据。Ⅲ期免疫学分析研究确定13/146具有免疫学活性。且Ⅱ期和Ⅲ期均对热加速降解样本进行了分析，结果表明13/146性质稳定。因此最终在2015年11月，WHO生物标准专家委员会通过13/146作为C-肽第1次国际标准品使用，C-肽含量为8.64 μg·安瓿^-1，扩展不确定度为0.43（95%可信限；k=2.45）。

6 讨论 6.1 本次协作标定情况分析

这次C-肽国际标准品候选品的定值为何不采用现行国际参考品84/510来标定呢？因为WHO认为84/510本身定值偏高，是在1986年通过有限的5个独立实验室7个放射免疫分析系统及当地标准品分析比较得到^[12]，数据量较少，不足以支持成为国际标准品，所以当时仅定义为国际参考品。此次研究结果表明，84/510效价也许接近9~9.5 μg·安瓿^-1。因此WHO放弃以84/510为标准标定13/146，而是采用理化方法（HPLC）对13/146进行准确、绝对定值，并可溯源至SI单位制。通过三期的研究（包括定值、稳定性研究和互换性研究），最终将13/146作为C-肽第1次国际标准品标准物质。Ⅲ期（包括Ⅲa和Ⅲb）研究重点在于分析13/146及其热加速降解样本的免疫活性，以及与现行国际参考品84/510比较，证明候选品（13/146）作为人C-肽国际标准品的适用性。

14个实验室共同完成了C-肽国际协作标定Ⅲa部分的研究。本实验室及其他实验室的数据显示，13/146具有与84/510类似的免疫反应性，表明引入13/146不会引起C-肽测定值整体分布的明显变化。但是，WHO以Ⅱ期研究中的HPLC标定结果（8.64 μg·安瓿^-1）为最终效价，而不以免疫分析方法测定均值为准，必然出现2种标定方法测定值不一致的局面，事实也的确如此，后者结果高于前者约13%左右。究其原因，因为这项研究中采用的试剂基本上都溯源至84/510，如果84/510效价偏高，那么整个校准系统测定值也会偏高，测得的13/146效价也将高于基于理化方法得到的效价。因此在报告最后，WHO提请各试剂厂商应了解采用13/146替换84/510对他们分析系统的潜在影响。

6.2 84/510测定分析

本实验室的数据结果与WHO统计Ⅲa研究结果趋势相同，直接测定13/146均值为9.98 μg·安瓿^-1，高出13/146最终定值（8.64 μg·安瓿^-1）约15.5%；以84/510为标准标定13/146测得均值（10.24 μg·安瓿^-1）比直接测定均值（9.98 μg·安瓿^-1）仅高出2.6%，但是高出13/146最终定值约18.5%。原因同上所述，各分析系统基本上都是溯源至84/510。WHO汇总84/510数据为9.20 μg·安瓿^-1，低于理论效价（10 μg·安瓿^-1）8%，本实验室上报的84/510均值为9.59 μg·安瓿^-1，低于理论效价4.1%。上报的19组数据中，仅1组别数据高于理论效价。这些数据可能从侧面也证实了84/510定值偏高。

不过值得注意的是，本实验室提供的放射免疫法试剂数据，因测定值显著低于其他方法测定值未被NIBSC采纳，这可能与放射免疫法试剂中采用的抗体为多克隆抗体，测定特异性不高，且放射免疫法为竞争性抑制反应，线性范围相对较窄，低浓度样本测定准确度降低有关。

6.3 不同缓冲液对C-肽测定影响

此次研究中，本实验室在5家分析系统上分别采用了WHO推荐用缓冲液（含0.1%BSA的PBS）与试剂专用稀释液，配制不同浓度的13/146，分析对测定值的影响。结果表明只有1家的免疫系统表现出显著差异。WHO报告中也提到，某家实验室采用推荐缓冲液，C-肽测定值显著偏高，而选择制造商推荐缓冲液（马血清），测定值合理。这些结果表明推荐使用的缓冲液可能与一些免疫系统不兼容，用户在进行量值溯源的时候，应首先找到适合自己免疫测定系统的缓冲体系。

6.4 C-肽测定的标准化

对于体内含量甚微，常规的理化方法不能直接测得的物质，如激素、肽类，最开始是通过放射免疫进行分析，后来随着技术进步，发展了多种标记免疫分析技术。其基本原理和过程是：将抗原-抗体反应的高度特异性与放射性（或其它非放射性）标记物的高度敏感性相结合，通过测定带有标记的抗原-抗体复合物的反应量（如放射性强度、发光值或者OD值），从剂量-反应曲线上推算出被测物的量。所以与常规化学、物理测定原理不同，这些微量物质的测定结果是相对的，是基于与标准物质比较，通过拟合曲线推算出来的^[13-14]，具有抗体特异性。因此这类物质国际或国家标准品的赋值，若是未建立公认的参考方法，则是通过与上一级或上一批标准品对比效价^[15]，采用多中心定值即综合各实验室不同方法得到的结果，选择适当的统计方法进行分析，最终确定标准品候选品效价。之前激素、蛋白或者肽类的免疫类标准物质，WHO多采用上述方法进行定值，但是此次C-肽第1次国际标准品候选品研究采用理化方法进行标定，是绝对定量，不同于上述的相对定量，2种方法结果存在一定差异。因此C-肽第1次国际标准品的建立和引入，将对绝大部分C-肽试剂生产厂商产生重大影响，整个校准体系将要以13/146为标准进行调整，这可能会影响到临床病理值的重新确定、正常值参考范围的改变等等，由此可以预见，整个调整过程将会持续一段时间。

【致谢：本协作研究工作得到了北京北方生物技术研究所、北京倍爱康生物技术有限公司、广州市达瑞抗体工程技术有限公司、四川迈克生物科技股份有限公司、深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司、雅培贸易（上海）有限公司、罗氏诊断产品（上海）有限公司、索灵诊断医疗设备（上海）有限公司、广州市达瑞抗体工程技术有限公司、西门子医学诊断产品（上海）有限公司的大力协助。】