医药产品，尤其是一次性针类的针尖硅化和一次性注射器的内壁硅化必须使用硅油，以增加其润滑性^[1-2]，由于常规硅油粘度较大，所以广泛使用消耗臭氧层物质，即一氟二氯乙烷（1-fluorine dichloroethane，HCFC-141b）和1，2-二氯-1，1，3，3，3-五氟丙烷（1，2-dichloro-1，1，3，3，3-five fluoro propane，HCFC-225）作为硅油稀释剂。目前我国医疗器械行业HCFCs（氢氯氟碳化物）的年使用量约为1 300吨左右。为履行保护臭氧层国际公约，按期淘汰HCFC-141b和HCFC-225^[3-5]，中国政府向蒙特利尔议定书多边基金申报的“清洗行业HCFCs淘汰管理计划”于2016年5月获批，计划2020年前完成该行业HCFCs的完全淘汰^[6]。

目前，我国已有自主研发的药物注射润滑用免溶剂硅油产品进入了上市前评价阶段，但由于免溶剂硅油产品的生产工艺改变，过程中涉及到材料改性工艺等，急需对其应用于人体的生物安全性进行评价。按照GB/T 16886.1—2011医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验附录A以及产品的用途，产品分类为外部接入器械且接触时间为短期（≤24 h），宜进行“体外细胞毒性试验、迟发型超敏反应试验、皮内反应试验、急性全身毒性试验、血液相容性试验”^[7]。本文对该新型药物注射润滑用免溶剂硅油产品的生物安全性开展全面评价，给出其在一次性医疗器械生产中应用的可行性分析。

1 免溶剂硅油的生物学评价试验

本文中免溶剂硅油样品均由上海某高新技术有限公司生产并提供，批号：150701，规格：6 g·瓶^-1，数量：5瓶。

1.1 细胞毒性试验^[8] 1.1.1 材料

介质：含血清MEM培养基；供试液制备：按照说明书要求清洗产品后，根据每0.2 g试验样品加入1 mL含血清细胞培养液的比例，（37±1）℃条件下浸提24 h，取浸提液用于试验；阴性对照：细胞毒性阴性对照品（中国食品药品检定研究院，批号：350006-201201），按3 cm²·mL^-1比例加入浸提介质；阳性对照：含10%二甲基亚砜（天津市福晨化学试剂厂，批号20140902）的完全培养基。

1.1.2 方法

将配制好的1×10⁵·mL^-1细胞悬液接种于96孔培养板，设空白对照、阴性对照、阳性对照和供试材料组，每组各设6孔，每孔接种100 μL细胞悬液。置CO₂培养箱（含体积分数5%二氧化碳气体，下同）37 ℃培养24 h后，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入阴性对照品浸提液，阳性对照组加入阳性对照品浸提液，供试样品组加入供试液，每孔100 μL，置CO₂培养箱继续培养24 h。于更换培养液后的24 h，置显微镜下观察细胞形态。每孔加入20 μL质量浓度为5 g·L^-1的MTT溶液，继续培养4 h后弃去孔内液体，加入150 μL DMSO，置振荡器上振荡10 min，在酶标仪570 nm和630 nm波长下测定吸光度，计算相对增殖率。

1.1.3 评价和统计

根据相对增殖率（表 1）按分级标准判定，阴性对照的反应应不大于1级，阳性对照组至少为3级反应。如阴性对照组和阳性对照组反应不成立时应重新试验。

1.2 致敏试验^[9] 1.2.1 材料

浸提介质：0.9%氯化钠注射液，批号：1508123204，生产厂家：石家庄四药股份有限公司；弗氏完全佐剂：批号：SLBM2183V，生产厂家：SIGMA。浸提液制备：4 g样品加20 mL浸提介质的比例，在37 ℃下将试验样品浸提72 h。用同样的方法制备无试验材料的浸提介质作为对照液。弗氏完全佐剂（FCA）与浸提介质以50：50（v/v）比例混合，制成稳定性乳化剂用于皮内诱导。10%（w/w）十二烷基硫酸钠（SLS）石蜡液用于局部诱导。

1.2.2 方法

选取HARTELY STRAIN白化豚鼠（Caviaporcellus）albino pigs；动物来源：中国食品药品检定研究院动物繁育中心；动物数量：15只；试验组10只，对照组5只，试验开始前1 d，先标识豚鼠并称量体重，用电动剃刀彻底剪除试验部位被毛。每天观察动物的一般状况。皮内诱导：动物后背前部成对注射弗氏完全佐剂与0.9%氯化钠溶液以50：50（v/v）比例混合的稳定性乳化剂；后背中部试验组成对注射试验样品浸提液，对照组成对注射阴性对照液；后背后部试验组成对注射试验样品浸提液以50：50（v/v）与弗氏完全佐剂混合配制成的乳化剂，对照组成对注射阴性对照液以50：50（v/v）与弗氏完全佐剂配制成的乳化剂。

1.2.3 局部诱导

皮内诱导阶段后7 d（±1 d），去除每只动物的试验区被毛，并用10%十二烷基硫酸钠（SLS）石蜡液处理。在注射部位将SLS按摩导入皮肤产生轻微的急性炎症反应。该部位不敷贴。SLS处理后第2 d，用纱布轻轻清除残留的SLS。试验组采用面积约8 cm²的敷贴片（滤纸或吸收性纱布块），在新鲜制备的样品浸提液浸透后局部贴敷覆盖于每只动物的诱导注射点。用封闭式包扎带固定敷贴片，并于48 h±2 h后除去包扎带和敷贴片。阴性对照组动物用相应对照液同法操作。

1.2.4 激发

激发前1 d，去除动物一侧腹背部的被毛。于局部诱导阶段后14 d（±1 d），将滤纸或吸收性纱布块分别置于试验样品浸提液和对照液中浸透，分别贴敷于每只动物的腹背部去毛区（诱导阶段未试验部位）。用封闭式包扎带固定，并于24 h±2 h后除去包扎带和敷贴片。

1.2.5 观察

除去敷贴片后24和48 h观察试验组和对照组动物激发部位皮肤反应情况，按Magnusson和Kligman分级标准（表 2）对每一激发部位和每一观察时间皮肤红斑和水肿反应进行描述并分级。

1.2.6 结果评价

按表 1中Magnusson和Kligman分级标准，对照组动物等级小于1，而试验组中等级大于或等于1时一般提示致敏。如对照组动物等级大于或等于1时，试验组动物反应超过对照组中最严重的反应则认为致敏。

1.3 皮内刺激试验^[9] 1.3.1 材料

浸提液制备：无菌条件下取样品2 g，加氯化钠注射液10 mL，于37 ℃恒温摇床内经24 h浸提，取浸提液用于试验。

1.3.2 方法

3只大耳白兔，由中国食品药品检定研究院动物繁育中心提供，动物生产许可证号SCXK（京2011-0010）。动物性别无特殊要求，体重不低于2 kg。试验开始前24 h，彻底去除动物背部脊柱两侧注射部位被毛。注射前，用75%的酒精棉球消毒去毛部位皮肤并使干燥。在每只兔脊柱一侧选5个点皮内注射样品浸提液0.2 mL，在脊柱另一侧选5个点皮内注射氯化钠注射液0.2 mL，各注射点之间相距2 cm。注射后即刻观察注射部位情况。之后将动物返回各自的笼内饲养。

注射之后24、48和72 h观察记录各注射部位红斑和水肿状况。反应分为0~4级。应注意注射部位的其他任何反应。按表 3给出的记分系统对每一观察期各注射部位的红斑和水肿的组织反应评分并记录试验结果。

在72 h评分后，分别将每一试验样品和浸提介质对照组的全部红斑和水肿记分相加，再除以18[3（动物数）×3（观察期）×2（记分类型）]，计算出每一试验样品和每一对应浸提介质对照的综合平均记分。如试验样品和浸提介质对照的综合平均记分之差不大于1.0，则符合标准试验要求。在任何观察期，如试验样品一般反应疑似大于浸提介质对照反应，应另取家兔重新进行试验，试验样品与溶剂对照的综合平均记分之差不大于1.0，则符合标准试验要求。

1.4 急性全身毒性试验^[10] 1.4.1 材料

样品制备：按0.2 g·mL^-1比例加入生理盐水。在37 ℃下浸提72个h，取上清液作为检测液。浸提介质作为空白对照。

1.4.2 方法

雄性昆明（SPF级）小鼠10只，中国食品药品检定研究院动物繁育中心。苦味酸染色标记，先标识小鼠并称量体重。按50 mL·kg^-1的剂量对5只样品组小鼠腹腔注射样品试验液，将相应的浸提介质以同样的方式注射对照组5只小鼠。之后将动物放回各自的笼内饲养。注射后即刻以及4、24、48和72 h观察小鼠是否出现不良反应。并在给药后、24、48、72 h观察和称量动物的体重。

1.4.3 评价和统计

如果在观察期间样品组小鼠的反应没有明显超过相应对照组的反应，试验样品符合要求。如果出现以下3种情况之一：（1）2只或以上的小鼠死亡；（2）2只或以上的小鼠出现异常的行为如痉挛或俯卧不动（或中度毒性症状）；（3）3只或以上的小鼠体重降低10%以上，则试验样品不符合要求。

1.5 溶血试验^[11-13] 1.5.1 材料

新西兰白兔，中国食品药品检定研究院动物繁育中心。新鲜稀释抗凝兔血的制备：健康家兔耳动脉取血，3.8%枸橼酸钠溶液1：9抗凝。取新鲜抗凝兔血4 mL，加入5 mL 0.9%氯化钠注射液中混匀，得到稀释抗凝兔血。取兔血1 mL，加入生理盐水至100 mL，制备出1%的稀释兔血。取0.4 mL兔血，加入生理盐水至20 mL，制备2%的稀释兔血。

1.5.2 方法

称取免溶剂硅油6 mg，加入1%稀释兔血15 mL，作为一个样品。制备3份。阴性对照组每管加入1%稀释兔血10 mL；阳性对照组每管加入2%稀释兔血5 mL+蒸馏水5 mL。每组平行3管。全部试管放入恒温水浴（37±1）℃中60 min。将水浴后的各组溶液以800 g离心5 min后，吸取上清液。在545 nm波长处读取各管上清液的吸光度。

1.5.3 数据处理

检测样品组和对照品组吸光度均取3管的平均值。阴性对照组的吸光度应不大于0.03，阳性对照组的吸光度应为0.8±0.3，否则应重新试验。

检测样品的溶血率按公式（1）计算：

$ {\rm{HR = }}\frac{{A - B}}{{C - B}} \times 100\% $

(1)

式中：HR——检测样品溶血率（%）；A——检测样品组平均吸光度；B——阴性对照组平均吸光度；C——阳性对照组平均吸光度。

2 试验结果 2.1 细胞毒性试验结果

试验样品的细胞增值度为95%，在该试验条件下，供试液的细胞毒性反应为1级。

2.2 致敏试验结果

所有动物均观察到皮内注射福氏完全佐剂（freunds complete adjuvant，FCA）所引起的预期的皮肤反应（表 4）。所有动物在整个试验过程中临床表现正常。

2.3 皮内刺激试验结果

注射后即刻所有注射点均无异常。记分情况见表 5。在该试验条件下，没有观察到家兔皮内注射浸提液后产生刺激的任何征象，试验样品组和相应浸提介质对照组的平均记分之差均小于1.0。在该试验条件下，均未观察到样品浸提液导致豚鼠出现迟发型超敏反应的迹象，见表 6。

2.4 急性全身毒性试验结果

每只动物的体重记录及生物学反应见表 7和表 8。在该试验条件下，样品检测液没有导致小鼠死亡或引起全身毒性反应的迹象。

2.5 溶血试验结果

在该试验条件下，免溶剂硅油的吸光度均值为0.028，阴性对照组的吸光度均值为0.010，阳性对照组的吸光度均值为0.847，免溶剂硅油的溶血率为2.2%，见表 9。

3 结论

经过细胞毒性、致敏、皮内刺激、急性全身毒性及溶血试验，在该试验条件下，新型药物注射润滑用免溶剂硅油试验样品细胞毒性试验结果为1级，样品检测液没有导致致敏反应、皮内刺激反应、溶血反应、小鼠死亡或引起全身毒性反应的迹象，具有较高的生物安全性，将有望替代传统溶剂型硅油产品，在一次性药品注射用医疗器械生产中使用。