2017, Vol. 37 
2. SCIEX APAC 应用中心, 北京 100015
2. SCIEX APAC Application Center, Beijing 100015, China
天麻素（gastrodin），又名天麻苷，化学名为4-羟甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（图 1），具有镇痛、安眠、抗惊厥等中枢抑制作用[1]，临床上广泛用于眩晕、头痛、神衰等，是急性头痛发作的首选药。天麻素是兰科多年生寄生植物天麻Gastrodia elate Blume中的主要活性成分[2]，于1979年从天麻中分离并合成[3-4]。天麻素注射液的质量标准在2001年上升至国家药品标准[5]，2014年再次标准提高[6]，国外药典无收载。该药每日用药量大[7]，国内外文献却未见对其杂质的系统研究报道。
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图 1 天麻素的化学结构 Figure 1 The chemical structure of gastrodin |
本研究基于质量源于设计（quality by design，QbD）理念，即高品质的产品源于优质的工艺设计[8]，对天麻素注射液的杂质谱进行研究[9-12]，采用Q-TRAP LC/MS/MS技术鉴定杂质结构[13-14]，并结合合成工艺及强力降解试验研究杂质来源，旨在为天麻素的工艺优化及质量控制提供参考依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器Waters e2695/2998高效液相色谱仪；岛津LC30A液相色谱-AB SCIEX 4500 Q-TRAPTM复合型三重四极杆/线性离子肼串联质谱仪；资生堂CAPCELL PAK C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶），Waters Acquity UPLCTM BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）。Mettler AE-160电子天平；北京永光明DZKW-D-4水浴锅。
1.2 药品与试剂天麻素注射液（2015年国家评价性抽验品种，200批，18家生产企业，典型样品的信息见表 1）；天麻素原料药（昆明制药，批号JT20151013；浙江诚意药业，批号0601-2014-12602）；天麻素对照品（中国食品药品检定研究院，批号110807-201306，含量96.8%）；杂质1（4-醛基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，委托昆明制药合成，纯度＞98.0%）；乙腈为HPLC级，对羟基苯甲醇、磷酸、盐酸、氢氧化钠和高锰酸钾为分析纯，水为自制纯化水。
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表 1 典型样品的样品信息表 Table 1 Information of typical samples |
采用资生堂CAPCELL PAK C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃，以乙腈-0.1%磷酸水溶液（3：97）为流动相，流速1.0 mL·min-1，检测波长220 nm，进样量10 μL。
2.2 Q-TRAP LC/MS/MS条件色谱条件：采用Acquity UPLCTM BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），柱温30℃，以乙腈-0.005 mol·L-1醋酸铵溶液（2：98）为流动相，流速0.25 mL·min-1，检测波长220 nm，进样量3 μL。
Q-TRAP质谱条件：采用负离子采集模式，多反应监测扫描模式，碰撞电压45 V；采用正离子采集模式，单离子监测扫描模式，碰撞电压45 V；电喷雾离子源（ESI）；线性离子肼扫描范围m/z 50~600；温度550 ℃，GAS1/2 379 kPa，喷雾电压5.5~4.5 kV。
2.3 供试品溶液的制备取天麻素注射液样品适量，加水稀释制成每1 mL中含0.5 mg的溶液，即得。
2.4 对照溶液的制备精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
2.5 强制降解试验本试验考察了酸、碱、高温、氧化4种条件的降解产物。取样品1 mL，置50 mL量瓶中，分别经0.1 mol·L-1盐酸10 mL室温放置24 h，0.1 mol·L-1氢氧化钠10 mL室温放置24 h，直接水浴回流4 h，0.2 mol·L-1高锰酸钾溶液1 mL室温放置20 h破坏，酸碱破坏样品用适量0.1 mol·L-1盐酸或0.1 mol·L-1氢氧化钠中和，各破坏后的溶液用水稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件分析，同时进行空白试验。酸、碱及氧化降解色谱图见图 2，由图看出，在该色谱条件下，各降解产物及天麻素主峰之间均能有效分离。
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1.杂质1（impurity 1）2.杂质2（impurity 2）3.杂质3（impurity 3）4.天麻素（gastrodin） A.酸破坏（destroyed by acid）B.碱破坏（destroyed by alkali）C.氧化破坏（destroyed by oxidation）D.天麻素注射液样品（sample of gastrodin injection） 图 2 降解试验HPLC色谱图 Figure 2 HPLC chromatograms of degradation tests |
采用“2.1”项下HPLC色谱条件对18家企业的200件样品及2家企业的原料药进行测定，测得供试品溶液的高效液相色谱图。共检出3种杂质（杂质1、杂质2、杂质3），结果见表 2，典型色谱图见图 2。分析各杂质的检出结果，杂质1在所有企业的样品及2家企业的原料药中均检出，且为最大单杂，有25批次的检出量为0.2%及以上，杂质2和杂质3在部分企业的样品中检出，杂质3在浙江诚意药业的原料药中检出。
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表 2 天麻素注射液有关物质测定结果 Table 2 Detection results of the related substances in gastrodin injection |
采用“2.2”项下Q-TRAP LC/MS/MS条件分析，典型色谱图见图 3，杂质1的质谱图见图 4，杂质3的质谱图见图 5。
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1.杂质1（impurity 1）3.杂质3（impurity 3） 4.天麻素（gastrodin） 图 3 天麻素注射液LC/MS/MS总离子流图 Figure 3 TIC profile of gastrodin injection |
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图 4 杂质1的二级质谱图 Figure 4 MS/MS spectrum of the impurity 1 |
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图 5 杂质3的二级质谱图 Figure 5 MS/MS spectrum of the impurity 3 |
采用Q-TRAP LC/MS/MS技术得到相对分子质量和二级质谱碎片信息，结合杂质的产生途径，根据化合物的一般裂解规律，推测化学结构。各杂质的分析结果见表 3。
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表 3 天麻素注射液杂质的质谱特征和推测结构 Table 3 Mass characteristics and proposed chemical structures of impurities in gastrodin injection |
4-醛基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（杂质1）：在相对保留时间2.25处测得。杂质1在氧化条件下随氧化时间延长而不断增大，说明其为氧化降解杂质，杂质1在2家企业的原料药及所有样品中均有检出，判断其也为合成工艺杂质。应用Q-TRAP LC/MS/MS技术进行分析，负离子模式下，一级全扫描测得准分子离子[M-H]-m/z为283.3，比天麻素对照品分子离子峰[M-H]-m/z 285.3少2。二级质谱测得的主要碎片离子m/z 121.2为[M-H-162]-，162为1个六碳糖分子，碎片离子m/z 121.2与对羟基苯甲醛的特征碎片离子吻合，因此确证杂质1即为4-醛基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，其分子式C13H16O7，相对分子质量284.3。质谱图见图 4。
对羟基苯甲醇（杂质2）：在相对保留时间1.91处测得。杂质2在酸碱条件下产生，并随水解时间延长而不断增多，说明其为酸碱水解杂质。查阅中国药典，检索到天麻素相关的杂质有对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛等[15-18]，采用HPLC对照比对法，比对出杂质2对应为对羟基苯甲醇，且在3D图上其紫外谱图完全一致；分析天麻素结构是对羟基苯甲醇苷元在酚羟基上连有1个葡萄糖苷的结构，在酸碱水解条件下，天麻素最易水解断裂的一定是酚糖苷键，糖苷键水解断裂生成对羟基苯甲醇苷元，与杂质2为酸碱水解杂质相一致，因此确认杂质2为对羟基苯甲醇，HPLC对照比对试验图谱见图 6。
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2.杂质2（impurity 2）4.对羟基苯甲醇（hydroxybenzyl alcohol） A.酸破坏（destroyed by HCl） B.碱破坏（destroyed by NaOH）C.对羟基苯甲醇对照品（4-hydroxybenzyl alcohol reference standard） 图 6 HPLC对照比对试验谱图 Figure 6 HPLC chromatograms of comparison test |
4-羟甲基苯基-二元糖苷（杂质3）：在相对保留时间1.38处测得。杂质3在破坏降解溶液中未见增加，在浙江诚意药业的原料药及部分制剂中检出，说明其为合成工艺杂质。应用Q-TRAP LC/MS/MS技术进行分析，负离子模式下，一级全扫描测得准分子离子[M-H]- m/z为447.2，正离子模式下，准分子离子[M+Na]+ m/z为471.1。二级质谱的主要碎片离子m/z 309.1为[M+Na-162]+，162是1个六碳糖分子，碎片离子m/z 309.1恰与天麻素加钠离子（286+23）一致，因此初步判断结构为天麻素结构上再加1个六碳糖；碎片离子m/z 347.0为[M+Na-124]+峰，124与天麻素苷元对羟基苯甲醇（C7H8O2）苷元特征离子一致；碎片离子m/z 441.1为[M+Na-30]+峰，30是1个水分子（H2O），丢失1个水分子说明苷元上有1个羟基。综上，判断结构是对羟基苯甲醇苷元在酚羟基上连有1个二糖的糖苷。质谱图见图 5。
2.7 杂质1的校正因子测定采用斜率比法对杂质1的校正因子进行测定。取天麻素对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1 mL中含43.79、87.58、131.37、175.16、218.95、262.74、306.53 μg的溶液；取杂质1适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1 mL中含2.87、4.78、23.91、38.26、119.55、239.10、478.20 μg的溶液。分别取上述溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，以峰面积Y为纵坐标，对浓度X进行线性回归，天麻素、杂质1的线性方程：
| $ \begin{gathered} Y = 2.03 \times {10^7}X - 5.68 \times {10^4}\;\;\;\;r = 1.000 \hfill \\ Y = 2.11 \times {10^7}X - 5.03 \times {10^3}\;\;\;\;r = 1.000 \hfill \\ \end{gathered} $ |
天麻素及杂质1的线性关系均良好。根据线性方程斜率计算得杂质1的校正因子为1.04，因此可以采用不加校正因子的主成分自身对照法计算杂质1的含量。
2.8 讨论本研究依据现行中国药典标准检验有关物质，对天麻素注射液及其原料的杂质进行检测分析，并结合Q-TRAP LC/MS/MS技术及强制降解试验对检出的3种杂质进行结构鉴定及来源归属。其中杂质1和杂质3都为合成工艺杂质，杂质1在所有样品中检出，其校正因子为1.04，杂质3在浙江诚意药业的原料药及部分制剂中检出，说明杂质3是浙江诚意药业原料药合成工艺的特有杂质。杂质2为酸碱降解杂质，在原料药中未检出，仅在少量样品中微量检出，因此该制剂在生产使用过程中应控制pH。本研究为天麻素合成工艺优化及其制剂质量控制提供了参考依据。
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