乌拉地尔（urapidil）化学名为6-{[3-[4-（2-甲氧苯基）-1-哌嗪基]丙基]氨基}-1，3-二甲基-2，4（1H，3H）-嘧啶二酮，为苯哌嗪取代的尿嘧啶衍生物，具有外周与中枢的双重作用，是周围α受体阻滞剂^[1-2]，临床上主要用于控制围手术期高血压，治疗高血压危象（如血压急剧升高）、重度及难治性高血压^[3-6]。

据有关文献报道^[7-12]，乌拉地尔存在多晶型现象，除乌拉地尔水合物和甲醇合物外，还存在晶型Ⅰ、晶型Ⅱ和晶型Ⅲ 3种晶型。前期研究将乌拉地尔原料药溶解于不同有机溶剂中，配成过饱和溶液，冷却使之结晶，得到不同形态的乌拉地尔晶体，并采用红外吸收光谱、差示量热扫描法、偏光显微镜、X射线粉末衍射等方法^{[9-10, 13]}对不同溶剂中的重结晶产物进行表征，结果与文献报道^{[7, 8]}基本一致。本研究拟采用溶出仪分析8种重结晶产物的溶解速率与时间的关系，并且通过外翻肠囊模型法研究不同结晶产物在大鼠小肠中的吸收情况，为乌拉地尔固体制剂中优势晶型的选择提供新的研究思路。

1 仪器与材料 1.1 仪器

LC-30AD超快速液相色谱仪（日本岛津公司），LC-30AD泵，SIL-30AC进样器，SPD-20A紫外检测器，Empower色谱工作站；ME235S电子分析天平（德国塞利多斯公司）；RCZ-8M溶出仪（天津天大天发公司）；SCQ-200超声波清洗器（上海声浦超声设备厂）；高纯水（美国Millipore公司）；恒温磁力电热套。

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱（Kromasil 100-5，C₁₈，4.6 mm×250 mm×5 μm；瑞典Nobel公司）。

1.2 药品与试剂

乌拉地尔对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100626-201302）；乌拉地尔原料（黑龙江福和华星制药有限公司，批号：101213，HPLC纯度：99.33%）；乌拉地尔8种溶剂重结晶产物（自制）；氯化钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁均为分析纯；乙腈为色谱纯；水为高纯水，其他均为分析纯。

1.3 实验动物

雄性SD大鼠，体重（250±20）g [西安交通大学医学实验动物中心，合格证号：SCKX（陕）2012-003]。

2 实验方法 2.1 色谱条件

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱（Kromasil 100-5，C₁₈，4.6 mm × 250 mm × 5 μm）；流动相：乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氢钠（20:80）；流速：1.0 mL·min^-1；检测波长268 nm。精密量取20 μL，注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算。

2.2 溶液的配制 2.2.1 Tyrode液

称取NaCl 8.0 g，NaHCO₃ 1.0 g，NaH₂PO₄ 0.05 g，KCl 0.3 g，MgCl₂ 0.1 g，溶于500 mL水中，冷藏；称取CaCl₂ 0.2 g，溶于500 mL水中，冷藏；临用前在不断搅拌下将两者混合均匀，并加入1.0 g葡萄糖，即得。

2.2.2 对照品溶液

精密称取乌拉地尔对照品适量，用流动相配制成浓度为10 μg·mL^-1的溶液，即得。

2.3 溶出曲线测定方法

利用溶出度测量法测定，在37 ℃条件下，蒸馏水为溶出介质，桨法测定，转速为50 r·min^-1。称取不同溶液重结晶的晶体各30 mg，溶于900 mL的溶出介质中，于5、10、15、20、30、40、60、90、120、150 min取样，补液，取溶液适量，0.45μm微孔滤膜滤过，去续滤液，装于液相小瓶中，按“2.1”项下色谱条件测定。

2.4 大鼠翻转肠囊实验

实验采用翻转肠囊法^[14-15]。实验前将大鼠禁食12 h，随机分组，每组5只。颈动脉取血处死后，分别取空肠、回肠各10 cm，结肠7 cm，放入Tyrode液中冲洗，至无内容物为止。小心剥离肠段表面的肠系膜和脂肪，用丝线将肠管一端结扎，小心将肠内外翻转，用Tyrode液清洗表面，另一端扎在20 mL注射器下口，使之形成囊状。经由注射器上口向肠囊中注入空白Tyrode液5 mL，将其移入已有Tyrode液的玻璃槽中平衡10 min。精密称取8种不同溶剂重结晶产物各10 mg，置200 mL烧杯中，在放入肠囊的同时向烧杯中加入Tyrode液200 mL，开始计时。实验过程中保持37 ℃恒温，并向烧杯中通入95% O₂/5% CO₂混合气体。在给药后10、20、30、40、60、90、120、150 min，从肠囊内取样500 μL，同时补足相同体积的37 ℃的空白Tyrode液。样品置5 mL带盖离心试管中，13 000 r·min^-1离心5 min，取上层澄清液，以0. 45 μm微孔滤膜过滤。取续滤液20 μL进样分析，按上述液相色谱法测定样品中乌拉地尔的含量。色谱图见图 1。实验结束后将肠段纵向剖开，自然摊于滤纸上测量长度和宽度，并计算肠段的吸收面积A。

2.5 数据处理 2.5.1 药物累积吸收量

${Q_n} = 5{C_n} + {V_s}\sum\limits_{i - 1}^{n - 1} {{C_i}} $

(1)

式中：Q为药物各时间的累积吸收量，C_n为n时间点的实际检测浓度，C_i为样品浓度，V_s为取样体积。

2.5.2 药物转运速率及表观渗透系数

Q对t做相关回归分析，得出斜率除以吸收表面积，即为肠段的转运速率V_t。

表观渗透系数计算公式：

${P_{aap}} = \frac{{\Delta Q}}{{\Delta t \times A \times {C_0}}}$

(2)

式中：ΔQ为药物在Δt时间内透过的量（μg）；A为药物透过的表面积（本模型中为肠腔中膜面积）；C₀为肠囊外侧的初始给药浓度。

3 实验结果 3.1 乌拉地尔不同溶剂重结晶产物的溶出曲线

采用外标法计算不同时间取样点溶出杯中乌拉地尔的浓度C，计算浓度C与初始理论浓度C₀的比值C/C₀，以时间t为横坐标，C/C₀为纵坐标，绘制成曲线如图 2所示。从图 2可知，不同溶剂重结晶产物在30 min内的溶解速率各不相同，30 min之后溶解趋于平缓。利用氯仿重结晶的乌拉地尔溶解度和溶出速率最高，二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇重结晶的乌拉地尔溶解度和溶出速率较好，异丙醇、乙醇-水、甲醇重结晶的乌拉地尔的溶解度最差。

3.2 同一晶体的乌拉地尔在不同肠段的吸收情况

乌拉地尔乙酸乙酯重结晶产物在十二指肠、空肠、回肠均有不同程度的吸收，并且在同一肠段中的单位面积单位浓度的Q值随时间的延长呈线性增加（图 3）。回肠的吸收参数Q₁₂₀（120 min累积吸收量）、V_t（转运速率）和P_aap（表观渗透系数）均高于空肠组和十二指肠组（P < 0.05），乌拉地尔在不同肠段吸收趋势为回肠＞空肠＞十二指肠，所以回肠段确认为最佳吸收肠段（结果见表 1），该研究结果与文献报道基本一致^[16]。

3.3 不同溶剂重结晶产物在同一肠段的吸收差异

乌拉地尔不同溶剂重结晶产物在大鼠回肠中的单位面积单位浓度的Q值随时间的延长呈一定增长趋势（图 4），不同重结晶产物的各吸收参数Q₁₂₀（120 min累积吸收量）、V_t（转运速率）和P_aap（表观渗透系数）如表 2所示。

采用SPASS17.0对表 2的数据进行分析，不同溶剂重结晶产物在大鼠同一肠段中的吸收情况差异较大，与乌拉地尔乙醇-水（1:1）重结晶产物组比较，氯仿、二氯甲烷、正丁醇重结晶产物的转运速率和表观渗透系数的差异有显著意义（P < 0.05），乙酸乙酯、异丙醇和甲醇重结晶产物的转运速率和表观渗透系数的差异没有显著意义（P > 0.05）。由此可见，氯仿、二氯甲烷和正丁醇的重结晶产物肠吸收较好，乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、乙醇-水（1:1）、甲醇重结晶产物肠吸收差异不明显。

4 讨论 4.1 乌拉地尔的优势晶型的确定

乌拉地尔在不同溶剂中结晶得到的产物不同，氯仿、二氯甲烷、正丁醇中得到的晶型Ⅱ比较多，丙酮、乙酸乙酯中得到的晶型Ⅱ减少和晶型Ⅲ增多，乙醇-水（1:1）和异丙醇中得到较多的晶型Ⅰ，甲醇中得到的结晶产物存在溶剂化物。其产物的溶解度和肠吸收也有较大的区别，氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇重结晶的乌拉地尔溶解度和溶出速率较好，甲醇重结晶的乌拉地尔的溶解度最差；氯仿、二氯甲烷、正丁醇重结晶产物肠吸速度较快，丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、乙醇-水（1:1）和甲醇重结晶产物肠吸收较慢。可见，含晶型Ⅱ较多的氯仿、二氯甲烷、正丁醇结晶产物，其相应的溶解度较大，溶出速度和肠吸收速率较高。溶解度强的结晶产物肠吸收好，肠吸收的差异与其溶解度有一定的关系。所以初步判断晶型Ⅱ为优势晶型。

4.2 工业生产中乌拉地尔重结晶溶剂的选择

目前，生产企业多采用乙醇水纯化和精制乌拉地尔原料，也有部分企业采用二氯甲烷作为溶剂、丙酮作为反溶剂重结晶精制乌拉地尔原料^[17-21]。乙醇-水（1:1）重结晶产物中晶型Ⅰ含量较多，过多的晶型Ⅰ会使得其相应的溶解速率和肠吸收速率降低，故不适合做工业生产溶剂。氯仿和二氯甲烷重结晶产物的溶解度与肠吸收最佳，但氯仿和二氯甲烷属于一类溶剂残留溶剂，毒性较强。正丁醇重结晶产物中Ⅱ型结晶含量较高，其相应的溶解度和肠吸收速率也较高，而且其沸点为117.7 ℃，实验过程中的溶剂挥发较小，是更适宜于乌拉地尔工业生产中重结晶用溶剂。