中药川芎为伞形科（Umbelliferae）藁本属（Ligusticum）多年生草本植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的根茎，主产于四川，云南、贵州、甘肃等地也有栽培^[1]。川芎具有活血行气、祛风止痛等功效，常用于胸痹心痛、胸胁刺痛、月经不调等的治疗^[2]。现代化学和药理研究表明，川芎的化学成分主要包括挥发油、酚酸类、生物碱类和内酯类等^[3-6]。

中药指纹图谱具有完整性、特异性和再现性的特点，已在中药质量控制和模式识别研究中得到了广泛应用^[7-8]。由于中药化学成分复杂，单波长检测下建立的指纹图谱很难全面反映化学成分的信息。多波长融合技术根据多种主要成分在不同检测波长下的最大或较大吸收绘制成若干色谱图，利用信息融合将各色谱图以最大峰面积覆盖融合，使其成为一张可以同时反映多个波长信息的图谱，该图谱信息更全面^[9-10]。基于多波长融合技术的川芎^[11]及其制剂^[12]指纹图谱研究已得到了应用，结果表明利用该技术建立的指纹图谱重复性良好，可区分药材来源，为川芎及其制剂质量控制提供了依据。但是该技术数据处理难度较大，尚未开发出专业软件，科研普及程度不高。

波长叠加技术常用于波谱学和色谱学定量分析中，其核心在于将不同检测波长下的信号值累加，用此技术所得的图谱不仅信息更加全面，而且还能与各化学成分形成良好的线性关系，为成分定量提供了条件，该技术在钯^[13]、乙醇^[14]和槲皮素^[15]等含量测定中表现良好。据此本文提出了多波长叠加指纹图谱的新方法，并在川芎分析中得到了良好的效果，该方法可为川芎的生药学研究、质量控制和评价提供科学依据。

1 试药与仪器 1.1 饮片和试剂

16个川芎购自国内各药店，具体来源见表 1。为验证指纹图谱可靠性和专一性，同时随机采购2个来源的藁本和2个来源的当归作为外类群。所购药材样品均由贵州大学刘金亮副研究员鉴定，川芎为植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，藁本为植物藁本L. sinense Oliv.的干燥根茎和根，当归为植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根。分析前40 ℃烘干至恒重，粉碎过50目筛，保存于-20 ℃的冰箱中。乙腈（色谱纯，Fisher Scientific，USA）；磷酸（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；超纯水（Millipore，USA）自制。

1.2 仪器

LC-20A高效液相色谱仪，配备DGU-20A3在线脱气机、SPD-20A紫外检测器、LC-20AB高压输液泵、CTO-10AS柱温箱和SIL-20A自动进样器（Shimadzu Corporation，Japan）；KQ-300GDV恒温数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；BT124s电子天平（Sartorius，Germany）；中草药粉碎机（天津泰斯特仪器公司）等。安捷伦Poroshell 120 EC-C₁₈色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.7μm），安捷伦Eclipse XDB-C₁₈保护柱（4.6 mm×12.5 mm，5μm）。

2 方法与结果 2.1 供试液的制备

精密称定样品0.5 g，加入70%甲醇水溶液10 mL，水浴超声（300 W、40 kHz）提取30 min，补重，摇匀，静置，上清液过0.2μm滤膜至进样瓶。

2.2 色谱条件

色谱柱：Poroshell 120 EC-C₁₈色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.7μm）接Eclipse XDB-C₁₈保护柱（4.6 mm×12.5 mm，5μm）。检测波长为230、260、290、320 nm，总流速为0.8 mL·min^-1，柱温35 ℃。流动相：A为0.1%磷酸水溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序：0~20 min，10%→32%的B；20~25 min，32%→46%的B；25~36 min，46%→55%的B；36~60 min，55%→80%的B；60~63 min，80%→10%的B；63~70 min，10%的B。

2.3 方法学考察 2.3.1 精密度试验

取样品C1供试液，按照上述色谱条件分析，平行6次，记录主要色谱峰的峰面积积分值，以第19号共有峰为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD为0.06%~0.25%，相对峰面积的RSD为0.85%~2.53%，说明方法精密度良好。

2.3.2 稳定性考察

取样品C1供试液，按照上述色谱条件，分别于制样后0、2、4、6、8、12 h进样测定，记录主要色谱峰的峰面积积分值，以第19号共有峰为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD为0.70%~1.61%，相对峰面积的RSD为0.36%~1.84%，说明方法稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

取样品C1，按上述方法平行制备6份供试液并上机检测，记录主要色谱峰的峰面积积分值，以第19号共有峰为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD为0.55%~1.18%，相对峰面积的RSD为0.74%~2.84%，说明方法重复性良好。

2.4 多波长叠加和指纹图谱构建

分别从Shimadzu Labsolution色谱工作站中导出不同检测波长下的AIA格式数据文件；使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件转换为TXT格式；然后利用EXCEL2013对TXT格式数据中的检测信号值进行全时段多波长叠加，指纹图谱拟合采用平均数法并另存为TXT格式；最后将TXT格式文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件作图。以样品和指纹图谱全时段的检测信号值为变量，利用SPSS23.0进行数据处理，斯皮尔曼相关系数表示样品与指纹图谱的相似度。对保留时间在0~55 min内的色谱峰进行分析，选择稳定性和重复性好、特征明显的色谱峰为共有峰。

根据上述方法所得的样品叠加图谱在峰数量和峰面积上都有所增加，能更加全面的反应川芎化学成分（图 1-A）。利用16个不同来源的川芎样品叠加图谱建立指纹图谱（图 1-B），样品图谱与指纹图谱的相似度在0.940~0.995之间（表 2），指纹图谱共标定22个共有峰。同时，川芎多波长叠加指纹图谱与其同属药材藁本和近缘种药材当归的相似度较低在0.235~0.725之间，表明该指纹图谱具有一定的鉴别作用，可作为川芎辨伪的手段。

2.5 主成分分析和聚类分析

以川芎、藁本和当归多波长叠加图谱全时段的检测信号值为原始数据，用SPSS23.0进行主成分分析，结果见表 3和图 2。从表 3可以看出前2个主成分特征值都大于1，累积方差贡献率达到93.134%，表明前2个主成分可以把川芎等20个样品化学特征的93.134%反映出来。图 2为20个样品主成分分析得分图，结果表明样品明显集中在2个区域内，其中一个全部为川芎饮片样品，另一个为藁本和当归样品。也表明叠加图谱能反映川芎饮片真实的化学特征，对鉴别具有一定作用。

以川芎多波长叠加图谱和指纹图谱（R）全时段的检测信号值为原始数据，导入SPSS23.0软件进行聚类分析。采用组间连接法，以余弦距离法作为样品间距离计算方法进行系统聚类分析，聚类结果见图 3。本结果与主成分分析结果有一致性，聚类树分成了2个主支，其中一支全部为川芎样品和指纹图谱，另一支为藁本和当归，川芎一支又进一步分成了若干次级分支。除四川作为川芎主产区外还有湖北、贵州、安徽、重庆等省，而本研究结果显示不同省份来源的川芎并未聚在一起，即川芎销售地与产地不一致，这也表明川芎的市场流通都是复杂多样的。

3 结论

本研究利用波长叠加方法建立了川芎指纹图谱，并结合相似度分析、主成分分析和聚类分析对市售川芎进行研究，表明多波长叠加法在中药材指纹图谱的应用上是可行的、可靠的。但是由于该方法数据处理仍较繁琐，基于波长叠加技术的中药材指纹图谱专业软件亟待开发。