2017, Vol. 37 
胃肠宁片是由布渣叶、辣蓼、番石榴叶、火炭母和功劳木5味中药经加工提取制成的中药片剂，为卫生部药品标准《中药成方制剂》第2册收载的药品，具有清热祛湿、健胃止泻之功效，临床上主要用于治疗急性胃肠炎和小儿消化不良[1]。处方中，布渣叶具有清热消滞、利湿退黄的功效[2]，主要含有山柰酚、异鼠李素等黄酮及其苷类成分[3]；辣蓼具有散瘀止痛、解毒消肿、杀虫止痒之功效，临床上用于治疗痢疾、胃肠炎、腹泻等症状，主要含有槲皮素、异鼠李素、山柰酚等黄酮及其苷类成分[4]；番石榴叶具有收敛、止泻之功效，主要用于急慢性肠炎、痢疾等疾病的治疗，含有槲皮素等黄酮类及没食子酸、阿魏酸等酚类成分[5]；火炭母具有清热利湿、凉血解毒之功效，用于治疗湿热泄泻、咽喉肿痛等病症，异鼠李素、芹菜素、槲皮素等黄酮类成分为其主要活性成分[6]；功劳木具有清热燥湿、泻火解毒，抗肿瘤之功效[7]，用于治疗湿热泻痢、目赤肿痛、黄疸型肝炎、褥疮[8]，主要含有巴马丁、药根碱等生物碱类成分[9]。目前，胃肠宁片所执行的质量标准还未收录含量测定项，仅有文献以功劳木中的生物碱为指标成分，建立了胃肠宁片中盐酸药根碱、盐酸巴马丁、盐酸小檗碱的SPE-HPLC和毛细管电泳含量测定方法[10-11]，未见以其他化学成分为指标成分的含量测定研究报道。鉴于中药复方成分的复杂多样，单类成分并不能完全反应其内在质量，故有必要建立多类成分的质量控制方法。处方中多味组成药的主要成分为黄酮和酚酸类成分，且该类化合物具有抗心律失常，抑制乙酰胆碱酯酶，抗炎，降糖等多种药理活性，常作为中药及其制剂质量控制的主要活性指标成分[12-14]。故本试验选取没食子酸、阿魏酸、槲皮素、山柰素、异鼠李素5个成分为指标成分，建立了胃肠宁片中该5个成分的HPLC含量测定方法，为胃肠宁片质量标准的提高和完善提供科学的依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器Waters 2695高效液相色谱仪，包括Waters e2489检测器，Empower工作站（Waters公司）；Gemini C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Phenomonex公司）；CPA225D型电子天平（赛多利斯公司）；KQ-500DE型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；纯水仪（易普易达科技有限公司）。
1.2 试药对照品没食子酸（批号110831-201204）、阿魏酸（批号110773-201012）、槲皮素（批号100081-201408）、山柰素（批号110861-201209）、异鼠李素（批号110860-201410）均购自中国食品药品检定研究院，纯度均≥98%；不同批次胃肠宁片购自百草堂大药房；色谱甲醇用于配制流动相，分析甲醇用于溶液制备，磷酸为分析纯，水为去离子水。
2 方法与结果 2.1 色谱条件采用Gemini C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃，以甲醇（A）-0.4%的磷酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序见表 1，流速0.8 mL·min-1，检测波长为270 nm（没食子酸）和360 nm（阿魏酸、槲皮素、山柰素、异鼠李素），进样量10 μL。
|
表 1 流动相梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution procedure of mobile phase |
精密称取没食子酸、阿魏酸、槲皮素、山柰素、异鼠李素的对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为512.6、124.3、163.5、35.8、41.6 μg·mL-1的混合溶液，摇匀，即得。
2.2.2 供试品溶液取胃肠宁片20片，除去包衣，研细，取约1.0 g，置100 mL锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，超声（500 W，40 kHz）处理30 min，过滤，残渣用80%甲醇洗涤3次，每次20 mL，合并滤液与洗液，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，即得。
2.2.3 阴性样品溶液依据处方制备缺布渣叶、辣蓼、番石榴叶、火炭母的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备溶液，摇匀，即得。
2.3 方法学考察 2.3.1 专属性试验分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱进样分析，结果见图 1。结果表明5个被测成分能达到完全分离，阴性对照无干扰。
|
1.没食子酸（gallic acid）2.阿魏酸（ferulic acid）3.槲皮素（quercetin）4.山柰素（kaempferide）5.异鼠李素（isorhamnetin） 图 1 不同检测波长下对照品（A）、供试品（B）和阴性样品（C）的HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A), sample(B)and negative sample(C)in different detection wavelength. |
分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。分别精密吸取10 μL注入HPLC分析，以峰面积Y对进样浓度X进行回归方程计算。取“2.2.1”项下混合对照品溶液逐级稀释，进样测定，当信噪比为10:1时测得定量限（LOQ），信噪比为3:1时测得检测限（LOD）。结果见表 2。
|
|
表 2 5个化合物的回归方程、线性范围、相关系数和检出限、定量限 Table 2 Linear regression data, LODs and LOQs of five active compounds |
精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积并计算RSD。结果显示没食子酸、阿魏酸、槲皮素、山柰素、异鼠李素的RSD分别为1.0%、0.56%、1.8%、1.5%、2.6%，表明仪器精密度良好。
2.3.4 稳定性试验取同一供试品溶液（样品批号20150106），按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样分析，记录峰面积并计算RSD。结果显示没食子酸、阿魏酸、槲皮素、山柰素、异鼠李素的RSD分别为1.8%、2.4%、1.2%、2.1%、2.5%，表明5个成分在甲醇溶液中24 h内稳定。
2.3.5 重复性试验取同一批号（20150106）样品，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，记录峰面积，计算平均含量及其RSD。结果显示没食子酸、阿魏酸、槲皮素、山柰素、异鼠李素的平均含量分别为2215.47、85.21、136.72、18.86、34.37 μg·g-1，RSD分别为0.72%、1.7%、1.2%、1.8%、2.2%。表明该方法重复性良好。
2.3.6 加样回收试验取已知含量的样品（批号20150106）6份，每份约0.5 g，加入约与样品中待测成分含量等量的对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，计算回收率。结果没食子酸、阿魏酸、槲皮素、山柰素、异鼠李素的平均回收率分别为100.0%、102.7%、97.9%、101.3%、98.8%，RSD分别为2.1%、1.8%、2.3%、1.9%、1.6%。
2.4 样品含量测定取3个批次胃肠宁片，除去包衣，研细，取约1.0 g，每个批次平行3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，以外标法计算含量，结果见表 3。
|
|
表 3 3批样品的含量测定结果（μg·g-1） Table 3 The contents of investigated compounds in 3 samples |
采用单因素变量法对提取方法（超声、回流）、提取溶剂（甲醇、乙醇）、溶剂浓度（60%、80%、100%）、提取时间（30、60 min）及料液比（1:25、1:50）进行考察，结果显示以50倍量80%的甲醇超声提取30 min所得含量最佳。
3.2 流动相和流速的选择由于被测成分均显一定的酸性，故选择酸性系统洗脱，本试验考察了甲醇-0.4%磷酸水溶液和乙腈-0.4%磷酸水溶液；结果显示，甲醇分离效果优于乙腈，可能是乙腈洗脱效果较强，无法使每个被测成分与相邻色谱峰完全分离。试验过程中发现当采用1.0 mL·min-1的流速时，改变洗脱程序均无法使阿魏酸达到完全分离，而采用0.8 mL·min-1的流速时即可。故试验最终选择甲醇-0.4%磷酸水溶液及0.8 mL·min-1的流速。
3.3 检测波长的选择据文献报道，没食子酸最大紫外吸收波长为270 nm[16]，阿魏酸为330 nm[11]，槲皮素、山柰素、异鼠李素为360 nm[13]。由于本实验使用的检测器为双波长检测器，综合考虑吸收峰对称因子、分离度、峰面积等因素后，确定以270、360 nm作为检测波长。
3.4 小结处方药各组成药之间具有协同或者拮抗作用，本文所选择的指标成分没食子酸、阿魏酸、槲皮素、山柰素、异鼠李素来自于处方中布渣叶、辣蓼、番石榴叶、火炭母多味组成药，并非是某一单味药的主要成分，能更完全的反映药物的内在质量，所建立的5个成分HPLC含量测定方法结果准确，操作简便，精密度、重复性、回收率均符合要求，可为其质量标准的制定和完善奠定基础。
| [1] |
卫生部药品标准. 中药成方制剂. 第二册[S]. 1990: 165. Drug Specifications Promulgated by the Ministry of Public Health, P R China. Ready Preparation of Traditional Chinese Medicine.Vol 2[S]. 1990:165 |
| [2] |
孙冬梅, 汪梦霞. 布渣叶化学成分和药理作用研究进展[J]. 世界中医药, 2015, 10(1): 143. SUN DM , WANG MX. Advances on chemical constituents and pharmacological effects of Microcos paniculata[J]. World Chin Med, 2015, 10(1): 143. |
| [3] |
杨茵, 李硕果, 叶文才. 布渣叶的化学成分研究[J]. 时珍国医国药, 2010, 21(11): 2790. YANG Y, LI SG, YE WC. Studies on chemical constituents of Microcos paniculata[J]. Lishizhen Med Mater Med Res, 2010, 21(11): 2790. DOI:10.3969/j.issn.1008-0805.2010.11.030 |
| [4] |
黄红泓, 甄汉深. 中草药辣蓼近年来的研究进展[J]. 中国民族民间医药, 2013, 22(1): 38. HUANG HH, ZHEN HS. Advances in research of Polygonum hydropoper L.[J]. Chin J Ethnomed Ethnopharm, 2013, 22(1): 38. |
| [5] |
吴艳, 曲玮, 梁敬钰. 番石榴叶的研究进展[J]. 海峡药学, 2013, 25(12): 14. WU Y, QU W, LIANG JY. Advances in research of Psidium guajava leaves[J]. Strait Pharm J, 2013, 25(12): 14. |
| [6] |
蔡家驹, 曾聪彦, 梅全喜. 火炭母化学成分与药理作用研究进展[J]. 亚太传统医药, 2014, 10(24): 32. CAI JJ, ZENG CY, MEI QX. Advances on chemical constituents and pharmacological effects of Polygonum Chinense Linn.[J]. Asia Pac Tradit Med, 2014, 10(24): 32. |
| [7] |
李克, 王天晓. 功劳木抗肿瘤作用机制研究进展[J]. 河南大学学报, 2010, 40(4): 399. LI K, WANG TX. Advances in anti-tumor mechanisms of Mahoniae[J]. J Henan Univ, 2010, 40(4): 399. |
| [8] |
侯艳红. 功劳木溶液联合麻油、白糖治疗褥疮的临床观察[J]. 大众科技, 2013, 15(11): 112. HOU YH. Clinical investigation on the efficacy of combinative treatment of Gonglaomu solution, sesame oil and sugar for bedsore[J]. Popul Sci Technol, 2013, 15(11): 112. DOI:10.3969/j.issn.1008-1151.2013.11.041 |
| [9] |
丛悦, 王艳, 王天晓, 等. 功劳木的化学成分研究[J]. 中成药, 2011, 33(6): 1008. CONG Y, WANG Y, WANG TX, et al. Chemical constituents from the stem of Mahonia bealei (Fort.) Carr.[J]. Chin Tradit Pat Med, 2011, 33(6): 1008. |
| [10] |
卢日刚, 张琳婧. 非水毛细管电泳法测定胃肠宁片中巴马汀小檗碱和药根碱含量[J]. 解放军药学学报, 2011, 27(6): 521. LU RG, ZHANG LJ. Determination of palmatine berberine and jatrorrhizine in Weichangning tablets by non-aqueous capillary electrophoresis[J]. Pharm J Chin PLA, 2011, 27(6): 521. |
| [11] |
丘明明, 黄玉华. SPE-HPLC法测定胃肠宁片中3种生物碱的含量[J]. 中成药, 2011, 33(2): 276. QIU MM, HUANG YH. Determination of three alkaloids in Weichangning tablets by SPE-HPLC[J]. Chin Tradit Pat Med, 2011, 33(2): 276. |
| [12] |
陈国辉, 佟玲, 杭太俊, 等. 超高效液相色谱法测定养血清脑颗粒中4个酚酸类成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2013, 33(1): 124. CHEN GH, TONG L, HANG TJ, et al. Determination of four phenolic acids in Yangxue Qingnao particles by UPLC[J]. Chin J Pharm Anal, 2013, 33(1): 124. |
| [13] |
刘杰, 许文, 李煌, 等. UPLC-MS/MS法同时测定白芍饮片中10种成分[J]. 药物分析杂志, 2015, 35(4): 635. LIU J, XU W, LI H, et al. Simultaneous determination of ten components in Radix Paeoniae Alba pieces by UPLC-MS/MS[J]. Chin J Pharm Anal, 2015, 35(4): 635. |
| [14] |
于姗姗, 李敏, 张秋. 一测多评法测定银杏叶中3种黄酮类成分的含量[J]. 中国执业药师, 2016, 13(3): 30. YU SS, LI M, ZHANG Q. Determination of three flavonoids ingredients in Ginkgo with multi-components by single-marker[J]. China Licens Pharm, 2016, 13(3): 30. |
| [15] |
董爱文, 朱春艳, 卓琦. 五爪龙外敷液中芹菜素与槲皮素的HPLC测定[J]. 天然产物研究与开发, 2014, 26(4): 230. DONG AW, ZHU CY, ZHUO Q. Simultaneous determination of apigenin and quercetin in external application in liquid of Potentilla kleiniana Wight et Arn. by HPLC[J]. Nat Prod Res Dev, 2014, 26(4): 230. |
| [16] |
张刚, 李国英, 徐晓琴. 高效液相色谱法测定痹通丸中没食子酸的含量[J]. 新疆中医药, 2012, 30(6): 52. ZHANG G, LI GY, XU XQ. HPLC determination of saiidroside and gallie acid in Rhodiola crenulate[J]. Xinjiang J Tradit Chin Med, 2012, 30(6): 52. |