2017, Vol. 37 
合成色素即人工合成的色素虽具有诸如色泽鲜艳，着色力强等诸多优点，但其毒性及致癌性，长久以来饱受安全性争议。特别是偶氮化合物类合成色素的致癌作用，在国际癌症研究机构（IARC）公布的化学物质对人体致癌性综合评价报告中，苋菜红、酸性红、日落黄均被列为三级致癌物。目前我国食品添加剂使用标准中允许使用的偶氮类色素有日落黄、柠檬黄、胭脂红、苋菜红、酸性红、诱惑红、新红、喹啉黄，非偶氮类色素有赤藓红、亮蓝、靛蓝。
我国食品安全国家标准GB 2760-2014规定了允许作为食品添加剂使用的11种食用合成色素的使用原则、使用范围及最大使用量。但合成色素作为药用，却未有明确的标准规定，中国药典2015年版既没有对明胶空心胶囊的色素检查项，也没有对允许使用的合成食用色素的种类和最大使用量做出规定。这就造成空心胶囊中食用合成色素的添加种类与添加量既无标准可循，又无明确管理办法，存在监管漏洞。
本文以药用明胶空心胶囊为研究对象，采用超高效液相色谱/三重四极杆质谱建立了22种合成色素的定量分析方法。
1 仪器与材料仪器：LC-MS/MS8050超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（岛津公司）
色谱柱：Hypersil GOLD十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（150 mm×3.5 mm 2.1 μm；Thermo公司）
IKA RV10旋转蒸发仪TC-502恒温水浴固相萃取仪（Agilent公司）0.22 μm为微孔滤膜（waters公司）Millipore超纯水机等
试剂：乙酸铵、乙腈（色谱纯德国merck公司），无水乙醇、甲醇（天津康科德试剂有限公司），200目聚酰胺粉（国药集团公司）等
色素对照品：柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、酸性红73、诱惑红、赤藓红、亮蓝、靛蓝均购自中国食品药品检定研究院；专利蓝、坚牢绿、孔雀石绿、喹啉黄、罗丹明B、碱性紫、金胺0、金橙Ⅱ、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ均购自德国Dr.Ehrenstorfer。
146批次药用明胶空心胶囊产品，均来自山东省药品安全质量风险监测抽样，分别抽自21家胶囊生产企业。
2 方法与结果 2.1 样品的制备参照GB/T 5009.35-2003食品中合成着色剂的测定中样品前处理方法[1]。因所选色素极性跨度较大，故提取过程中增加水与乙腈的提取，同时将G3垂熔漏斗纯化改为固相萃取柱纯化，减少解吸液的使用。称取胶囊1.0 g，置50 mL离心管中，加60 ℃水10 mL，超声（500 W，40 kHz）10 min，3 000 r·min-1离心5 min，取上清液置蒸发皿中，按上述方法重复提取3次，再以60 ℃无水乙醇-水（7:3）与乙腈同法依次提取。水提取物无需纯化，移至蒸发皿，置水浴锅上蒸发至近干，待用。取有机相提取液合并上清液，置60 ℃水浴上蒸至近干，加入2 g聚酰胺粉，使色素完全吸附，将聚酰胺粉上固相萃取小柱，分别以乙醇-水（30:70）、无水乙醇-2%氨水-水（7:2:1）、乙腈为解吸液各10 mL，重复提取3次，依次提取，洗至聚酰胺粉无色；收集解吸液，旋蒸浓缩，合并水提取物，加50%乙腈定容至10 mL量瓶中，经0.22 μm滤膜过滤，进样分析；根据需要，对含色素浓度超出线性范围批次，进行25倍、50倍稀释。
2.2 对照品溶液的配制精密称取或量取胭脂红、苋菜红、日落黄、赤藓红、诱惑红、柠檬黄、新红、靛蓝、亮蓝、喹啉黄、酸性红73、坚牢绿、孔雀石绿、专利蓝、罗丹明、碱性紫、金胺0、金橙Ⅱ、苏丹Ⅰ、苏丹Ⅱ、苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ各色素对照品适量，加50%乙腈溶解并稀释配制至适宜浓度，作为对照品储备液。综合考虑食品中限用色素的允许添加限度与质谱响应值，最终确定标准品溶液中10种限用色素浓度为5~500 mg·L-1，12种禁用色素的浓度为0.002~12.5 mg·L-1。
2.3 液相色谱-质谱条件液相色谱条件：流动相A：10mMol乙酸铵+0.1%甲酸流动相B：乙腈，梯度洗脱（见表 1）；检测波长：254 nm、500 nm；柱温：35 ℃进样量：1μL；质谱条件：电喷雾离子源（ESI）雾化气流速：3.0 L·min-1；加热气流速：10.0 L·min-1；干燥气流速：10.0 L·min-1；接口温度：300 ℃；脱溶剂管温度：200 ℃；加热器温度：300 ℃；扫描方式：多反应检测模式（MRM）分段扫描。
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表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution procedure |
首先运行单个对照品的全扫描，确定特征母离子与离子模式；再通过MRM自动优化，选定各色素的两组子离子（1组作为定量离子，1组作为定性离子）及碰撞电压，22种合成色素基本信息及质谱条件见表 2。
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表 2 种合成色素基本信息及质谱条件 Table 2 The basic information of 22 synthetic pigments and mass conditions |
因所选色素颜色、结构差异较大，故紫外最大吸收波长跨度较大，紫外检测波长较难选定。以254 nm波长处吸收作为对照品溶液的液相色谱图见图 1，MRM色谱图见图 2.
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图 1 对照品溶液的液相色谱图 Figure 1 The chromatogram of standard solution |
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（11 min~20 min局部放大图） 1.柠檬黄（tartrazine）2.新红（new red）3.苋菜红（amaranth）4.胭脂红（carmine）5.日落黄（sunset yellow）6.诱惑红（allura red）7.坚牢绿（fast green）8.亮蓝（brilliant blue）9：喹啉黄（quinoline yellow）10.酸性红（carmosine 73）73 11.金胺O（auramine）12.金橙Ⅱ（orange Ⅱ）13.专利蓝（patent blue）14：靛蓝（indigo）15.孔雀石绿（malachite green oxalate）16.赤藓红（erythrosine）17.罗丹明B（rhodamine B）18.碱性紫（methyl violet）19.苏丹红Ⅰ（sudan red Ⅰ）20.苏丹红Ⅱ（sudan red Ⅱ）21.苏丹红Ⅲ（sudan red Ⅲ）22.苏丹红Ⅳ（sudan red Ⅳ） 图 2 对照品溶液的MRM色谱图 Figure 2 The MRM spectrogram of standard solution |
为避免滤膜吸附，致使测定结果偏低，采用标准品溶液分别经直接进样与经滤膜过滤后进样；测定各合成色素响应值的变化。比较了津腾0.22 μm有机滤膜与waters Acrodisc syringe 0.22 μm滤膜的吸附性。经验证，2种滤膜对赤藓红、碱性紫、苏丹Ⅰ~Ⅳ等色素均有不同程度吸附，但waters Acrodisc syringe 0.22 μm滤膜明显优于津腾0.22 μm有机滤膜。采用waters Acrodisc syringe 0.22 μm滤膜，除赤藓红回收率为92.1%，碱性紫、苏丹Ⅰ~Ⅳ为77%~85%，其它各合成色素的回收率均在95%~101%之间。
2.7 方法的精密度、线性、检出限与定量限取同一对照品溶液连续进样6次，22种色素峰面积的相对标准偏差为0.1%~4.8%。取对照品储备液，加50%的乙腈稀释配制成10%~200%的标准品溶液，按上述条件分析，以定量离子对峰面积与相应浓度进行线性回归，得到回归方程，线性关系均良好。取对照品溶液，加50%的乙腈逐步稀释至适宜浓度，根据其计算所得信噪比，以3倍与10倍信噪比（S/N）对应浓度，计算检出限与定量限，测定结果详见表 3。
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表 3 各合成色素精密度、线性与检出限 Table 3 The precision, linerity and detection limit of synthetic pigments |
称取未加任何色素的透明胶囊1.0 g，置50 mL离心管中，加入标准品溶液1 mL，分别考察提取液用了（分别加入提取液60 ℃水、60 ℃无水乙醇-水（7:3）与乙腈各5、10、15 mL依次提取3次；）、考察超声时间（超声5、10、15 min）与解吸液用量（各5、10、15 mL），考察方法的提取效率。经考察，提取液/解吸液每次用量为5 mL时，提取/解吸不完全，仍有部分色素不能完全提取；提取液/解吸液每次用量为10 mL时，色素提取/解吸完全，胶囊/聚酰胺粉颜色基本呈无色；提取液每次用量为15 mL时，色素提取完全，溶剂量使用大，导致后续蒸干所需时间延长；超声时间过短，仍有部分色素积聚在离心管底部，不能完全提取；超声10 min与超声15 min，提取效果均较理想。根据考察结果确定提取方法为：“称取供试品1.0 g，置50 mL离心管中，加60 ℃水10 mL，超声（500 W，40 kHZ）10 min，3 000 r·min-1离心5 min，取上清液置蒸发皿中，按上述方法重复提取3次，再以60 ℃无水乙醇-水（7:3）与乙腈同法依次提取。水提取物无需纯化，移至蒸发皿，置水浴锅上蒸发至近干，待用。取有机相提取液合并上清液，置60 ℃水浴上蒸至近干，加入2 g聚酰胺粉，使色素完全吸附，将聚酰胺粉上固相萃取小柱，分别以乙醇-水（30:70）、无水乙醇-2%氨水-水（7:2:1）、乙腈为解吸液各10 mL，重复提取3次，依次提取，洗至聚酰胺粉无色；收集解吸液，旋蒸浓缩，合并水提取物，加50%乙腈定容至10 mL量瓶中，经0.22 μm滤膜过滤，进样分析”。
2.8.2 方法回收率称取未加任何色素的透明胶囊1.0 g，置50 mL离心管中，分别加入对照品溶液0.8、1与1.2 mL，按照上述方法进行处理后，每个浓度平行3份样品测定加标回收率和RSD。除苏丹Ⅰ~Ⅳ回收率在72.1%~75.2%外，其他各色素加标回收率在75.9%~100.3%，RSD在1.4%~5.3%，测定结果详见表 4。
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表 4 22种合成色素加标回收率及RSD Table 4 The recoveries and RSD of 22 synthetic pigments |
使用建立的方法对抽验的146批次明胶空心胶囊进行测定，采用各色素线性方程计算样品中色素浓度，采用下式计算胶囊中色素含量：
色素（g·kg-1）=C×V/W
其中C：线性方程计算所得色素浓度 V：供试品稀释体积 W：供试品称样量
2.10 结果分析GB 2760-2014规定允许作为食品添加剂使用的11种合成色素中，共检出8种，分别为柠檬黄、亮蓝、胭脂红、赤藓红、苋菜红、诱惑红、日落黄、喹啉黄，其中柠檬黄与亮蓝使用频率较高；禁用的合成色素中，15批次样品检出坚牢绿。其中柠檬黄、亮蓝、胭脂红、赤藓红、日落黄GB 2760-2014规定允许作为食品添加剂使用量最大为0.5 g·kg-1；苋菜红、诱惑红允许使用的最大量为0.3 g·kg-1，多批次产品检出上述色素超限数倍使用。虽多种色素存在超出食品限度添加使用的情况，但根据各色素的ADI值与用药要求，正常食用胶囊剂药物，尚无安全风险。坚牢绿属禁用合成色素，15批次样品添加量在0.000 4~0.029 g·kg-1之间，详见表 5，定性质谱图见图 3。
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表 5 146批次样品合成色素添加使用情况 Table 5 The analysis result of the addition of synthetic pigments in 146 batches of samples |
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a.MRM b.一级（primary）c.二级质谱图（secondary） 图 3 检出样品中坚牢绿定性质谱图 Figure 3 The qualitative Mass spectrogram obtained from sample |
建立了明胶空心胶囊中22种合成色素的液相色谱-三重四极杆质谱定量分析方法。样品采用水、无水乙醇-水、乙腈分次提取，对极性跨度较大的22种合成色素，均可实现有效提取。采用三重四极杆定量分析，10种限用色素线性浓度范围为5~500 mg·L-1，12种禁用色素的线性浓度范围为0.002~12.5 mg·L-1；22种合成色素均得到有效提取，加标提取回收率为72.1%~100.3%，检出限为0.5~284 μg·L-1。该方法对药用明胶空心胶囊中合成色素的定量分析有良好的适用性。对146批次明胶空心胶囊的分析结果令人担忧。多家胶囊生产企业多批次样品添加色素总量大于1.0 g·kg-1，合成色素滥用充斥着整个胶囊生产企业。明胶空心胶囊作为药用辅料也允许加入着色剂，但目前未有药用级着色剂的品种、限量要求和相关法定的检测标准。鉴于合成色素的危害性，其在制药工业中的使用品种、使用限量和安全性评价以及标签标示管理等方面应引起重视。
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