2017, Vol. 37 
2. 贵州省食品药品检验所, 贵阳 550004;
3. 贵阳中医学院, 贵阳 550002
2. Guizhou Institute for Food and Drug Control, Guiyang 550004, China;
3. Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China
青钱柳Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinsk为胡桃科青钱柳属植物，是中国特有的单种属植物，是国家重点保护的濒危植物之一[1]。其在降血压、降血糖、降血脂、增强机体免疫力、抗氧化等作用方面具有较为明显的优势，被称为“天然胰岛素”和“植物界的大熊猫”[2-4]。因而目前对青钱柳进行了大量人工种植培育。现关于青钱柳的研究主要集中在植株的培育，化学成分的提取及测定，药理活性研究等[5-7]，有关青钱柳重金属及有害元素的研究较少。李婷婷等按照相关食品标准对青钱柳中的重金属铅、砷、汞的含量进行测定，但未对其检测方法进行方法学报道[8]。李磊，曾珠亮等采用原子吸收分光光度法对青钱柳中微量元素，如铁、锌、铜等进行测定[9-10]。青钱柳属于自然环境中生长的植物类药物，为检测其在生长、加工等环节是否存在有害重金属元素的污染，本文采用全自动石墨炉消解法对样品进行处理，利用石墨炉原子吸收分光光度法测定青钱柳中铅、镉，利用火焰原子吸收分光光度法测定青钱柳叶中铜，利用原子荧光分光光度法测定青钱柳叶中砷，采用压力罐消解法对样品进行消解，利用原子荧光分光光度法测定青钱柳中汞，并对不同来源青钱柳中重金属的残留量进行检测与分析。为建立青钱柳质量控制和评价标准提供科学依据。
1 仪器与试药ICE3500原子吸收光谱仪，镉、铜、铅空心阴极灯（Thermo Fisher），全自动石墨消解仪DEENA Ⅱ（美国Thomas Cain）；AFS-9700双通道原子荧光光度计，HAF-2砷、汞空心阴极灯，IFS-9700注射泵（北京海光仪器公司）；XS205电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；EG35 plus微控数显电热板（苏州江东精密仪器有限公司）；DHG-9240A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；聚四氟乙烯消解罐（南京瑞尼克科技开发有限公司）。65%硝酸、盐酸、硫脲、硼氢化钾、氢氧化钠等试剂均为优级纯，水为超纯水。铅（Pb）、镉（Cd）、砷（As）、汞（Hg）、铜（Cu）标准溶液（质量浓度均为：1 000μg·mL-1）均来源于国家有色金属及电子材料分析测试中心（批号分别为：GSB04-1742-2004、GSB04-1721-2004、GSB04-1714-2004、GSB04-1729-2004、GSB04-1725-2004）。本试验所用样品经贵州省食品药品检验所标本馆馆长李杨主管药师鉴定为胡桃科青钱柳属植物青钱柳Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinsk的干燥叶，样品粉碎后过120目筛，置干燥器中备用。
2 方法与结果 2.1 标准储备溶液的配制分别精密量取Pb、Cd、Cu单元素标准溶液适量，用1%硝酸溶液稀释，制成质量浓度分别为Pb 1μg·mL-1、Cd 100 ng·mL-1、Cu 50 μg·mL-1的标准储备液；精密量取As单元素标准溶液适量，用超纯水稀释，制成质量浓度为0.2 μg·mL-1的标准储备液；另精密量取Hg单元素标准溶液适量，用5%硝酸溶液稀释，制成质量浓度为0.1 μg·mL-1的标准储备液，4 ℃贮存。
2.2 供试品溶液制备 2.2.1 测定Pb、Cd、Cu供试品溶液取青钱柳药材粉末0.5 g，精密称定，置消解管中，将消解管置入全自动消解仪中，加入硝酸8 mL，浸泡过夜。优选消解系统的工作条件为：震荡120 s，120 ℃消解60 min，150 ℃消解20 min，加入硝酸8 mL，震荡120 s，160 ℃消解40 min，加入高氯酸3 mL，震荡120 s，160 ℃温度保持60 min，消解同时赶酸至样品呈湿盐状，剩余1 mL左右，冷却，用水定容至25 mL，即得测定Cd、Cu的供试品溶液，用水定容至50 mL，即得测定Pb供试品溶液。同法同时制备试剂空白溶液。
2.2.2 测定As供试品溶液精密吸取“2.2.1”测定Cd、Cu的供试品溶液8 mL至10 mL的离心管中，加入50%盐酸1 mL，50 g·L-1硫脲1 mL，摇匀，于35 ℃烘箱中放置30 min，即得。同法同时制备试剂空白溶液。
2.2.3 测定Hg供试品溶液取青钱柳药材粉末0.5 g，精密称定，置压力消解罐中，加入硝酸8 mL，浸泡过夜，于160 ℃的电热鼓风干燥箱中消解4 h，冷却，在120 ℃的电热板上赶酸，冷却，用水定容至25 mL，即得供试品溶液。同法同时制备试剂空白溶液。
2.3 分析方法Pb、Cd采用石墨炉原子吸收分光光度法测定，基体改进剂为1%磷酸二氢铵与0.2%硝酸镁，仪器工作参数为：灯电流为：9 mA；进样量为：10 μL；狭缝宽度：0.5 nm；氩气流量为0.2 L·min-1；波长分别为：283.3、228.8 nm。石墨炉升温程序为：第一次干燥温度为：100 ℃，保持30 s；第二次干燥温度为150 ℃，保持30 s；灰化温度为800 ℃，保持20 s；原子化温度为1 300 ℃，保持3 s；净化温度为：2 500 ℃，保持3 s。Cu采用火焰原子吸收分光光度法测定，仪器工作参数为：波长为：324.7 nm；灯电流为：3 mA；狭缝宽度：1 nm；空气流量为：6.5 L·min-1；乙炔流量为：1.0 L·min-1。As、Hg采用原子荧光分光光度法测定，以1.5%硼氢化钾溶液和0.2%氢氧化钠溶液作为还原剂，以5%盐酸溶液为载液，仪器工作参数为：原子化器高度8 nm；负高压为：260 V，载气流量为：400 mL·min-1，屏蔽气流量为：600 mL·min-1；加热温度：200 ℃；灯电流分别为：60、20 mA。
2.4 线性关系考察 2.4.1 Pb、Cd、Cu线性方程分别精密量取Pb、Cd、Cu标准储备液适量，用1%硝酸液配制成含Pb分别为0.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0 ng·mL-1，含Cd分别为0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ng·mL-1，含Cu分别为0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 μg·mL-1的标准系列溶液。按照“2.3”项下方法进行测定，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得线性方程及相关系数分别为：
Y=0.007 12X+0.016 8 r=0.996 1
Y=0.153 99X+0.025 3 r=0.996 1
Y=0.081 38X+0.011 4 r=0.996 7
线性范围分别为：0.0~40.0 ng·mL-1、0.0~4.0 ng·mL-1和0.0~4.0 μg·mL-1。
2.4.2 As线性方程精密量取As标准储备液适量于25 mL量瓶中，加入少量的超纯水后，分别加入盐酸和50 g·L-1硫脲各2.5 mL，摇匀，定容，配制成含As分别为0.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 ng·mL-1的标准系列溶液。按照“2.3”项下方法进行测定，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得线性方程及相关系数：
Y=74.78X+7.159 r=1.000
线性范围为：0.0~16.0 ng·mL-1。
2.4.3 Hg线性方程精密量取Hg标准储备液适量，用5%硝酸液配制成含Hg分别为0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ng·mL-1的标准系列溶液。按照“2.3”项下方法进行测定，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得线性方程及相关系数为：
Y=356.4X-2.976 r=1.000，
线性范围为：0.0~4.0 ng·mL-1。
2.5 精密度考察取“2.4”项下Pb、Cd、As、Hg、Cu质量浓度分别为20.0 ng·mL-1、3.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、2.0ng·mL-1、1.0 μg·mL-1的标准溶液，按照“2.3”项下方法分别连续进样6次，记录吸光度，计算各重金属元素吸光度的RSD，结果Pb、Cd、As、Hg、Cu的RSD分别为1.3%、1.6%、2.1%、2.2%、2.2%，表明仪器精密度结果良好。
2.6 检出限取“2.2”项下的试剂空白溶液，按照“2.3”项下的方法，连续测定11次，记录吸光度，计算其标准偏差，标准偏差的3倍与工作曲线斜率的比值即为检出限。Pb、Cd、As、Hg、Cu的检出限分别为：0.070 51、0.005 261、0.006 700、0.005 422、1.044 mg·kg-1。
2.7 重复性考察取同一来源样品（贵州省剑河县5月份采摘）6份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项下的方法测定，记录吸光度，计算各组分含量及RSD，结果Pb、Cd、As、Hg、Cu的平均含量分别为1.671、0.277 6、0.345 6、0.086 19、8.509 mg·kg-1。RSD分别为1.7%、2.4%、1.8%、2.4%、2.1%。表明该方法具有良好的重复性。
2.8 稳定性考察取同一份供试品溶液（贵州省剑河县5月份采摘），按“2.3”项下方法分别于0，2，4，8，12，18，24 h进样测定，记录吸光度，计算各时间点间各组分吸光度的RSD，结果Pb、Cd、As、Hg、Cu的RSD分别为2.6%、1.5%、1.6%、1.4%、2.0%，表明供试品溶液在24 h内能稳定性良好。
2.9 回收率试验取已知Pb、Cd、As、Hg、Cu含量的青钱柳样品（贵州省剑河县5月份采摘）各9份，精密称定，每份约0.25 g。分别按低、中、高3个浓度加入“2.1”项下的各重金属元素对照品储备液适量（Pb加入量为：250.0、450.0、550.0 ng，Cd加入量为：35.00、65.00、87.00 ng，As加入量为：40.00、80.00、94.00 ng，Hg加入量为：10.00、20.00、24.00 ng，Cu加入量为：1.250、2.250、2.750 μg），再分别按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项下的方法测定，每个浓度平行测定2份，记录吸光度，计算各组分的平均回收率分别为：89.6%、90.1%、92.2%、96.4%、92.1%，RSD分别为：3.3%、3.2%、2.9%、2.7%、2.9%。表明回收率良好，该方法有效可行。
2.10 样品含量测定分别精密称取12批不同来源的青钱柳样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下的方法测定，含量测定结果见表 1。
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表 1 不同来源样品5种重金属元素含量测定结果（mg·kg-1，n=2） Table 1 The determination results of the 5 heavy metals from different areas |
本研究中采用全自动石墨炉消解法处理的样品可用于Pb、Cd、As、Cu的测定，该方法从精确添加各种试剂到加热、赶酸、定容等全程均可由软件控制，简便快捷，可避免腐蚀性酸对实验人员的危害，且消解管采用环绕式加热，整体受热均匀，精度更高，重复性更好[11]。但该方法的消解过程属于全敞开式，且为了更完全地对样品进行消解，消解过程中加入硝酸和高氯酸，消解的温度较高，而汞既易挥发也易吸附，不适合采用全自动石墨炉消解法，所以采用压力罐消解法进行消解，该方法消解完全，简便，重复性良好[12-13]。
3.2 重金属残留量分析参考中国药典2015年版一部对部分植物药材，如，金银花、白芍、甘草、丹参等重金属及有害元素的限量规定[14]，同时结合《WM/T 2-2004药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》对药用植物原料、饮片、提取物制剂的重金属限量的统一规范[15]，即：铅不得过5 mg·kg-1，镉不得过0.3 mg·kg-1，砷不得过2 mg·kg-1，汞不得过0.2 mg·kg-1，铜不得过20mg·kg-1。本研究对12批不同来源的青钱柳Pb、Cd、As、Hg、Cu的含量进行测定，结果分别为0.974 3~4.058、0.054 4~0.276 4、0.321 2~0.768 5、0.085 36~0.146 2、5.259~16.68 mg·kg-1，均未超出限量值，表明本研究中青钱柳叶样品重金属及有害元素污染程度较低，安全性相对较好。5种重金属元素中Cu的含量较高，Cd与Hg的含量较低。但青钱柳是否对铜元素具有较强的富集作用还有待进一步研究。
青钱柳是在自然环境中生长的植物，由于社会工业化发展越来越迅速，重金属及有害元素易在土壤、空气及水中富集，再加农药化肥及加工过程的可能代入，其存在重金属及有害残留物质污染的概率较髙。因此，本研究通过对青钱柳叶5种重金属Pb、Cd、As、Hg、Cu的残留量进行检测与分析，对其安全性进行了初步探讨，为完善其质量控制方法和促进相关产品的开发提供科学依据。
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