2017, Vol. 37 
2. 宁波戒毒研究中心, 宁波 315010;
3. 宁波市药品检验所, 宁波 315048
2. Ningbo Drug Research Center, Ningbo 315010, China;
3. Ningbo Institute for Drug Control, Ningbo, 315048, China
选择性的5型磷酸二酯酶（PDE5）抑制剂包括西地那非、他达拉非、伐地那非、乌地那非等，主要用于治疗男性勃起功能障碍（ED）[1]。具有治疗ED作用的PDE5抑制剂多达几十种[2-3]，补肾壮阳类中成药中非法添加PDE5抑制剂的事例层出不穷[4-10]。非法添加的化学药品往往使用未经GMP认证的化工产品，并且随意添加剂量；同时由于医生和患者的不知情，将完全忽略非法添加的药物与患者正在应用的其他药物可能产生相互作用，甚至忽略了禁忌证，这都将给使用者带来直接或潜在的伤害[11]。目前PDE5抑制剂检测方法依照国家食品药品监督管理局颁布的现行检验标准检测11种非法添加成分[12]。然而不法生产者为了规避检查，极可能添加现行标准检测范围之外的其他类似物。因此对保健食品的非法添加进行追踪分析具有重要意义。
本实验采用HPLC-DAD进行补肾壮阳类保健食品中非法添加筛查时发现有一个未知的他达拉非类似物，经过正相硅胶薄层色谱分离纯化得到目标物后，用UPLC-MS/MS得到其分子量和结构碎片，用核磁共振得到碳谱和氢谱数据，最终鉴定了目标物的结构为二乙氨基前他达拉非。
1 仪器与试药Waters 2695-2996 HPLC仪（美国Waters公司），色谱柱为迪马Inertsustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Waters Alliance-Quattro Micro液相色谱-质谱联用仪（美国Waters公司），色谱柱为Waters BEH C18键合硅胶柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；Bruker AV400型核磁共振仪（德国Bruker公司）；SB-5200DTN超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；R200D型电子分析天平（德国赛多利斯公司）。
氨基他达拉非对照品（Toronto research chemicals Ins公司，Cat#A629550；Lot#1-KMW-55-1），保健食品一批，为宁波市食品药品监督管理局提供的市场监督抽查样品。硅胶GF254薄层色谱板（青岛海洋化工厂）；氘代二甲亚砜（Bruker公司）；氯仿（分析纯）、乙酸铵（分析纯）；甲醇（HPLC级）；水为超纯水。
2 方法与结果 2.1 对照品溶液制备称取氨基他达拉非对照品约1 mg，置10 mL量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即得氨基他达拉非对照品溶液。
2.2 供试品溶液制备取供试品2片，研细，置50 mL量瓶中，加乙腈40 mL，超声提取15 min，放冷至室温，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过，得供试品溶液。
2.3 筛查的液相色谱条件及结果 2.3.1 筛查的液相色谱条件色谱柱：迪马Inertsustain C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）；流动相：以磷酸三乙胺溶液（取三乙胺7 mL用水稀释至1 000 mL，用磷酸调pH至2.8）-甲醇-乙腈（60:20:20）为流动相A，磷酸三乙胺溶液（取三乙胺7 mL用水稀释至1 000 mL，用磷酸调pH至2.8）-甲醇-乙腈（8:46:46）为流动相B，进行梯度洗脱（0~12 min，100%A；12~25 min，100%A→100%B；25~30 min，100%B；30~31 min，100%B→100%A；31~40 min，100%A），DAD扫描，波长范围200~400 nm，检测波长230 nm，流速为1.0 mL·min-1，进样量20 μL。
2.3.2 筛查的结果在该批保健食品中发现1个色谱峰，其保留时间在氨基他达拉非之前，二者DAD扫描图基本一致（图 1）。因此推测该化合物可能具有与氨基他达拉非相同的结构母核，是他达拉非的类似物。
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图 1 样品溶液HPLC色谱图（A），氨基他达拉非紫外光谱图（B），保健食品中未知化合物紫外光谱图（C） Figure 1 HPLC chromatogram of the sample(A), UV spectrum of aminotadalafil(B)and the unknown compound in the health food(C) |
取保健食品30片，研细，置锥形瓶中，加乙腈100 mL，超声（功率300 W，频率50 kHz）萃取20 min，滤过，滤液浓缩，用硅胶GF254薄层板，以氯仿-甲醇（10:0.6）为展开剂展开，刮取目标化合物条带，置锥形瓶中，加乙腈50 mL，超声20 min，滤过，滤液挥去溶剂，得透明固体，即为目标化合物。
2.5 目标化合物质谱和核磁共振碳、氢谱分析 2.5.1 质谱条件喷雾离子源（ESI），正离子检测；离子源温度：120 ℃；毛细管电压3.0 kV，锥孔电压30 V，碰撞能量20 V，扫描方式采用母离子扫描和子离子扫描2种模式，质量数范围100~500。
2.5.2 测试溶液的制备取分离纯化所得目标化合物约1 mg，加乙腈10 mL溶解，即得测试溶液。
2.5.3 目标化合物的分子量扫描和质谱裂解规律分析取测试溶液，直接进样做分子量扫描，得到464.0[M+H]+和485.99[M+Na]+2个峰值，可知该化合物相对分子量为463，与文献[3]综述的他达拉非类似物均不相同，为一新的他达拉非类似物。以464.0为母离子进行子离子扫描，得到结构碎片（图 2A）。二级质谱碎片质荷比分别为m/z464→m/z379→m/z334→m/z264→m/z135。质谱裂解途径见图 2B。
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图 2 目标化合物的子离子扫描质谱图（A），质谱裂解途径（B） Figure 2 Daughter scan MS spectrum of the target compound(A), and MS fragment pathways(B) |
1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ:10.83（1H，s），7.51（1H，d，J=8.0 Hz），7.26（1H，d，J=8.0 Hz），7.08（1H，t，J=7.2 Hz），7.00（1H，t，J=7.2 Hz），6.76（1H，t，J=8.4 Hz），6.73（1H，s），6.66（1H，s），6.45（1H，d，J=8.0 Hz），5.95（2H，d，J=4.0 Hz），5.76（1H，d，J=6.4 Hz），3.62（1H，m），3.49（1H，m），3.20（2H，m），3.00（1H，m），3.00（3H，s），2.54（2H，m），2.48（2H，m），0.93（6H，m）。
核磁共振碳谱数据13C-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：171.53（C=O），170.99（C=O），147.31，146.93，136.79，134.51，130.80，126.44，122.78，121.92，119.08，118.50，111.66，109.62，107.91，106.79，101.40（O-CH2-O），58.35（CH2），52.07，52.02，51.07（CH），47.24（2个CH2），21.61，11.78（2个CH3）。
HSQC谱显示δ21.61的碳同时与δ3.49和δ3.00的氢相关，表明该碳上2个氢原子的化学环境差异显著，符合他达拉非类化合物具有手性碳的结构特点。HMBC谱显示δ3.00的氢与δ171.53的碳相关，依此归属了与甲氧基相连的羰基碳。经过HSQC、HMBC及COSY谱分析，结合文献[13]，最终确定该目标化合物为二乙氨基前他达拉非，结构见图 3。碳谱和氢谱数据归属见表 1。
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图 3 目标化合物的结构图 Figure 3 The structure of the target compound |
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表 1 二乙氨基前他达拉非的核磁共振数据归属（DMSO-d6） Table 1 NMR data of diethylaminopretadalafil |
为保险起见，本实验还对保健食品样品进行了液相质谱分析，结果表明分离得到的化合物就是保健食品中非法添加的未知物，见图 4。
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图 4 保健食品样品UPLC-MS/MS色谱图 Figure 4 UPLC-MS/MS chromatograms of the health food sample |
色谱柱：Waters BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸溶液-甲醇（60:40）；流速：0.2 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。
2.6.2 质谱条件模式为电喷雾离子化（ESI）方式，多反应监测（MRM），检测离子为正离子。干燥气流量为500 L·h-1，雾化气流量为50 L·h-1，氩气流量：0.1 mL·min-1；取样锥孔电压30 V，碰撞能量：464 > 378.9，20 V；464 > 333.9，20 V。
3 讨论二乙氨基前他达拉非可能由氯前他达拉非与二乙胺反应而得，是他达拉非结构母核闭环前的中间体[13]，目前尚未见有关该化合物药理毒理活性数据的报道，不法生产者将其添加到保健食品中，使消费者面临极大的健康风险。
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