口腔溃疡散Ⅱ号收载于北京市《医疗单位制剂规程》^[1]，是我院使用量最大的口腔外用制剂^[2]，由青黛、雄黄、人工牛黄、龙胆、黄柏、冰片和甘草七味药材经过筛混匀、灭菌后制成，具解毒收敛作用，用于口腔溃疡可促进溃疡面愈合。方中青黛性味咸、寒，清热解毒、凉血消肿，为君药，主要的活性成分是靛蓝和靛玉红^[3]。该制剂项下未设置质量标准，为保证临床用药安全有效，笔者在建立处方中青黛、人工牛黄、黄柏和龙胆4味药物的薄层色谱定性鉴别方法^[4]的基础上，对处方君药青黛中2个指标性成分靛蓝和靛玉红的含量同时进行测定。中国药典2015年版（一部）青黛项下，靛蓝和靛玉红分别以不同溶剂提取，在不同的液相条件进行检测^[3]，操作烦琐。近年来也有一些采用HPLC法同时测定靛蓝和靛玉红含量的文献报道^[5-11]，以N，N-二甲基甲酰胺^[5-7]、氯仿^[8-9]、一定比例的氯仿-甲醇^[10-11]、甲醇-1%冰醋酸溶液（50:50）^[12]等不同溶剂进行样品提取，提取方式由回流提取^[8-10]改进到操作更为简便的超声提取^[5-7、12]，采用不同的液相色谱条件进行测定，分析时间普遍较长，多在20~40 min，仅有1篇测定单一药材青黛的文献分析时间小于10 min^[7]，但试验发现不适用于多种药味组成、成分复杂的复方制剂。本文采用正交设计对超声提取方法进行优化，建立了同时测定口腔溃疡散Ⅱ号中靛蓝和靛玉红含量的HPLC方法，可在5 min内快速完成测定，简便、准确，重复性好，为该制剂的质量控制提供了实验依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、化学工作站）；SK3310 HP型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；DT-100型单盘分析天平（北京光学仪器厂）；XA205DU电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SHB-ⅢA型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 试药

靛蓝对照品（纯度：98.3%，批号：110716-201111）、靛玉红对照品（批号：110717-200204），均购自中国食品药品检定研究院；口腔溃疡散Ⅱ号（批号：130901，131101，140101，140201，140301，140401）、青黛的阴性对照样品均为北京大学口腔医院自制，所用饮片购自中国药材公司；乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 混合对照品溶液

精密称取靛蓝对照品7.60 mg、靛玉红对照品2.52 mg，分别置于10 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺适量，超声（功率180 W，频率53 kHz）使溶解，加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，摇匀，作为对照品储备液。依次精密吸取靛蓝储备液0.8 mL、靛玉红储备液0.25 mL置于同一10 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀，得到每1 mL含靛蓝59.77 μg、6.30 μg的混合对照品溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液

取本品约0.3 g，精密称定，置100 mL磨口锥形瓶中，精密加入N，N-二甲基甲酰胺30 mL，称定重量，在40~45 ℃条件下超声（功率180 W，频率53 kHz）提取40 min，放冷，称定重量，用N，N-二甲基甲酰胺补足减失的重量，滤过，续滤液以0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.3 阴性对照品溶液

取缺青黛的阴性对照样品0.3 g，按“2.1.2”项下制成阴性对照溶液。

2.2 正交设计优化提取条件

参考文献^[5-12]，预实验分别考察了0.3 g供试品以30 mL不同的溶剂—N，N-二甲基甲酰胺、三氯甲烷、甲醇、三氯甲烷-甲醇（2:8）和甲醇-1%冰醋酸（50:50）等超声提取30 min时的效果，结果N，N-二甲基甲酰胺对供试品中靛蓝和靛玉红的提取率最高，确定提取溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。选择溶剂用量、提取时间、提取温度为主要考察因素，采用正交表L₉（3⁴）进行正交试验优化提取条件，以每1 mg样品中靛蓝、靛玉红峰面积为指标，将9个试验中靛蓝、靛玉红峰面积最大者计为100分，其余8个按比例折算，2个指标得分之和计为总分，对结果进行分析，正交试验结果见表 1、表 2。由表中结果可知，影响靛蓝和靛玉红提取的因素大小依次为A > C > B，A因素有显著性差异，B、C因素无显著性影响。确定最优提取方法为A₂B₃C₃，即0.3 g供试品用N，N-二甲基甲酰胺30 mL在40~45 ℃条件下超声提取40 min。

2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C₁₈（填料：十八烷基硅烷键合硅胶，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（65:35）；流速：1.0 mL·min^-1；检测波长：286 nm，柱温：20 ℃，进样量：10 μL。在上述色谱条件下，靛蓝、靛玉红的理论塔板数均大于3 000。

2.4 专属性试验

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液，按上述色谱条件进样，比较3种溶液的HPLC图。结果表明，供试品中靛蓝和靛玉红与相邻组分色谱峰分离良好，阴性对照品溶液色谱峰对测定无干扰，见图 1。

2.5 线性关系的考察

分别精密吸取混合对照品溶液1、2、3、5、8、10、12、15、20 μL，在上述色谱条件下分别进样进行测定。以进样量（X，ng）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得靛蓝和靛玉红回归方程分别为：

Y=3.774X-21.90 r=1.000

Y=4.190X+2.938 r=0.999 8

结果表明，靛蓝和靛玉红分别在59.77~1 195 ng和6.300~126.0 ng范围内的线性关系良好。

2.6 精密度试验

取样品（批号：140401），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，测得靛蓝、靛玉红峰面积的RSD（n=6）分别为0.06%、0.79%。结果表明，仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取样品（批号：140401），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样，测得靛蓝、靛玉红的平均含量（n=6）分别为6.23、0.52 mg·g^-1，RSD分别为2.3%、2.3%。

2.8 稳定性试验

取“2.6”项下供试品溶液，在室温下放置，分别于0、2、4、6、8、12、18、20、24 h进样分析，测定峰面积。靛蓝、靛玉红峰面积的RSD（n=9）分别为1.7%、2.5%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批号（批号：140401，靛蓝、靛玉红的含量分别为6.233、0.523 mg·g^-1）样品6份，每份约0.15 g，分别准确加入靛蓝、靛玉红的对照品储备液1.24、0.38 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，计算回收率。结果靛蓝、靛玉红的平均回收率（n=6）分别为99.1%、100.4%，RSD分别为2.8%、2.1%。

2.10 样品含量测定

取5批样品，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，每批次溶液制备5份，在上述色谱条件下进样，测定每批次5份样品中靛蓝、靛玉红的峰面积。采用外标法计算靛蓝、靛玉红的含量，结果见表 3。

3 结论与讨论 3.1 流动相系统的选择

在有关文献的基础上，分别考察了不同比例的甲醇-水^[5-6、9-11]、甲醇-0.1%醋酸溶液、乙腈-水^[7]、乙腈-0.1%醋酸溶液^[12]等流动相系统。结果表明：供试品中靛蓝、靛玉红在甲醇-水（70:30）、甲醇-0.1%醋酸溶液（70:30）、乙腈-水（65:35）、乙腈-0.1%醋酸溶液（65:35）4种流动相系统中均能得到基线平稳的色谱图，分离效果无明显差别。而甲醇-水（0.1%醋酸溶液）为流动相时的仪器色谱柱压力是乙腈-水（0.1%醋酸溶液）的2倍，可能影响仪器和色谱柱的稳定及性能，且后者的分析效率可以提高一倍，考虑到操作简便、保护仪器、经济实用，最终选用乙腈-水作为流动相系统。

3.2 柱温的选择

柱温直接影响色谱峰区域展宽和分析速度^[13]，本文分别考察了20、25、30、35 ℃不同柱温对供试品被测成分色谱图的影响。结果表明：色谱柱压力随柱温升高呈线性下降，每升高1 ℃，柱压下降约0.656 bar；柱温每升高5 ℃，靛蓝、靛玉红的保留时间分别前移约0.10 min、0.12 min，靛玉红比靛蓝受柱温的影响较大；柱温为20、25、30、35 ℃时，靛蓝、靛玉红与相邻色谱峰的分离度分别为3.08、2.74、2.49、2.00，选用分离度最佳的20 ℃作为柱温。

3.3 检测波长的选择

本试验通过PDA全波长扫描，靛蓝、靛玉红分别在286 nm、290 nm有最大吸收。同时将靛蓝、靛玉红在286 nm和290 nm时的色谱峰面积与各自最大吸收波长的色谱峰面积进行比较，靛蓝（3 000.8、3 536.3）、靛玉红（556.0、586.0）色谱峰面积分别减少15.1%、5.1%，靛蓝比靛玉红更易受到检测波长的影响，最终选定靛蓝有最大吸收的286 nm作为测定波长。

3.4 小结

本文采用HPLC法，同时测定口腔溃疡散Ⅱ号君药青黛中靛蓝和靛玉红的含量，方法简便、准确、可靠，可为该制剂的质量控制提供参考。中国药典2015年版（一部）规定青黛项下靛蓝、靛玉红的含量分别不得少于2.0%、0.13% ^[3]，本文中样品测定结果表明不同批次的口腔溃疡散Ⅱ号两指标成分的含量均符合规定。靛蓝和靛玉红为同分异构体，溶解性受温度影响很大，见光易分解，制备和储存应尽量避光^[5]。试验发现，供试品溶液放置36 h时靛蓝含量减少6.35%，靛玉红增加1.16%，两者可能相互转化，建议1 d内完成提取测定。