柴胡为伞形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狭叶柴胡（B. scorzonerifolium Willd.）的干燥根，按性状不同，有“北柴胡”和“南柴胡”之分。其性味辛、苦，微寒；归肝、胆、肺经；具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气之功；临床用于治疗感冒发烧、寒热往来、胸胁胀痛、月经不调、子宫脱垂、脱肛等症^[1]。目前对柴胡的质量控制研究较多，主要集中在黄酮类^[2]和皂苷类化合物^[3-7]，而皂苷类成分是柴胡药材疏肝解郁功效主要物质基础^[8-10]，中国药典2015年版一部也将柴胡皂苷a、d作为柴胡药材主要质量控制指标。辐照技术是20世纪兴起的一种灭菌及保鲜技术，是以Χ射线、γ射线或高速电子束等电离辐射产生的高能射线抑制病虫害的继续而达到杀虫、杀菌等目的^[11]。早在1997年，卫生部发布了《⁶⁰Co辐照中药灭菌剂量标准》（内部试行）的通知（卫药发[1997]第38号），对部分药材的吸收剂量做了规定，这也标志着辐照技术在医药工业行业的应用得到了主管部门许可，可以用作中药材中微生物灭活手段。但与食品相比，作为治病救人的中药材成分复杂，若使用不当，辐照存在较多安全隐患^[12]，辐照杀菌对药材内在活性成分也有一定影响，王二兵等^[13]研究了钴[⁶⁰Co]辐照灭菌对止嗽立效口服液主要成分的影响，黄赵刚等^[14]研究了不同剂量钴[⁶⁰Co]辐照对制痂酊中儿茶素和表儿茶素含量的影响。

本研究采用钴[⁶⁰Co]对柴胡药材进行辐射，建立皂苷类成分柴胡皂苷a、c、d含量检测方法，比较辐照前后含量变化，并最终给出最大辐照强度条件，为柴胡药材及其配方制剂的生产灭菌提供一定的参考依据。

1 仪器和试药

Waters公司2695型高效液相色谱仪（包括2489型紫外检测器，Empower 2色谱工作站）；Agilent公司SB-C₁₈柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）。深圳市金鹏源辐照技术有限公司辐照源为⁶⁰Co-γ射线辐照设备；梅特勒公司BS110型电子天平；昆山超声波仪器有限公司KQ-250DB型数控超声波清洗器（功率250 W）；默克密理博公司Milli-QAcademic超纯水系统；天津泰斯特仪器有限公司FW177型中草药粉碎机。

对照品柴胡皂苷a（批号110777-201510，含量以93.2%计）、柴胡皂苷d（批号110778-201510，含量以97.3%计）购自中国食品药品检定研究院；柴胡皂苷c（批号wkq-00114，含量≥98%计）购自四川省维克奇生物科技有限公司；胰酪胨大豆琼脂培养基（批号：151222），沙氏琼脂培养基（批号：1512143），pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：160107）均由北京三药科技开发公司生产；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

柴胡药材（批号150634、151175、151239、160234、160312、160121），购自黑龙江药材市场，经作者鉴定为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根。取药材分别以剂量5、8、10 kGy辐照处理。

2 方法与结果 2.1 灭菌效果检查

取辐照48 h的供试品，粉碎，称取10 g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，浸泡，充分振摇，制成1:10的供试液，按10倍稀释法制得1:100、1:1 000的供试液。取制备好的供试液l mL，置直径90 mm的无菌平皿中，注人15~20 mL温度不超过45 ℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养，除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30~35 ℃培养3~5 d，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20~25 ℃培养5~7 d，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有需氧菌总数、霉菌和酵母菌菌落数，计数并报告。结果见表 1。从表 1可以看出，随着辐照剂量增加，药材含菌量显著降低，可见钴[⁶⁰Co]辐照能有效除去柴胡药材中细菌。

2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品溶液

分别精密称取柴胡皂苷a对照品20.15 mg，柴胡皂苷c对照品22.32 mg及柴胡皂苷d对照品25.08 mg，置同一25 mL量瓶中，用甲醇超声溶解并稀释至刻度，制成每1 mL中分别含柴胡皂苷a 0.806 mg，柴胡皂苷c 0.893 mg，柴胡皂苷d 1.003 mg的混合溶液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 供试品溶液

取药材适量，粉碎过4号筛，取粉末约1.0 g，精密称定，置250 mL具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇溶液50 mL，密塞，超声处理（功率250 W，频率40 kHz，35 ℃水温）45 min，用定量滤纸滤过，用甲醇40 mL分2次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱：VenusiASB-C₁₈柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸水溶液-乙腈系统，梯度洗脱（0~10 min，15%乙腈；10~30 min，15%→40%乙腈；30~40 min，40%乙腈；40~50 min，40%→60%乙腈；50~60 min，60%→80%乙腈）；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL·min^-1；柱温：30 ℃，进样量：10 μL。取混合对照品溶液10 μL注入色谱仪，结果如图 1，各色谱峰分离较好，理论板数以柴胡皂苷c计大于3 000。

2.4 方法学考察 2.4.1 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液1、5、10、15、20、40 μL，按照本研究的色谱条件进行测定，记录色谱图，以峰面积（Y）为纵坐标，对照品质量浓度（X）为横坐标，分别绘制各组分标准曲线并进行回归计算。结果各组分线性关系良好。取混合对照品溶液适量，用甲醇逐步稀释，吸取10 μL进行测定，取峰面积的信噪比为10倍（S/N=10）时的对照品浓度为定量限（LOQ），回归方程及定量限见表 2。

2.4.2 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样5次，记录色谱图，以峰面积计柴胡皂苷a、c、d的RSD（n=5）分别为0.9%、1.2%和0.2%，说明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验

取柴胡药材适量，粉碎过4号筛，取细粉约1 g，精密称定，按供试品溶液制备方法平行制备6份溶液，依“2.3”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。结果柴胡皂苷a、c、d的平均含量（n=6）分别为3.126、1.153、5.241 mg·g^-1，RSD分别为0.3%、1.1%和0.4%，表明重复性良好。

2.4.4 稳定性试验

取同一供试品溶液，设置液相色谱仪的样品室及柱温箱温度为30 ℃，分别于0、3、6、9、12、15、18、24 h进样测定，记录色谱图。结果以峰面积计柴胡皂苷a、c、d的RSD（n=8）分别为0.7%、1.4%和0.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 加样回收率试验

取柴胡药材粉末6份，每份约0.5 g，精密称定，分别加入柴胡皂苷a、c、d对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，按“2.3”项下色谱条件进行分析，记录色谱图，计算各成分回收率，结果见表 3。

2.5 样品测定

取辐照前后柴胡药材粉末6批，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行分析，记录色谱图，将峰面积代入回归方程分别计算柴胡皂苷a、c、d的含量，结果见表 4。经成组t检验，柴胡皂苷a的含量辐照前后两组之间差异无统计学意义，辐照前后柴胡皂苷c、d两组之间存在显著差异（P＜0.05），可以认为辐照前后柴胡皂苷a含量变化不大，而柴胡皂苷c、d含量变化较大。

3 讨论 3.1 辐照剂量的选择

取3批柴胡药材（批号160234、160312、160121），分别以剂量0、5、8、10 kGy辐照处理后，粉碎过筛，称取适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行分析，记录色谱图，按外标法计算各组分含量，考察其含量随辐照强度变化关系，结果见图 2。

从图 2可以直观看出，柴胡皂苷a、d在辐照剂量不高于10 kGy时含量变化不大，而柴胡皂苷c受辐照强度的影响最大，在5 kGy剂量下，含量较辐照前基本变化不大，当剂量增加到8 kGy时，含量降低明显，这与“2.5”项下对含量数据进行的成组t-检验结果一致，建议为防止柴胡皂苷c降解过度，钴[⁶⁰Co]辐照强度不宜高于5 kGy。

3.2 提取条件的选择

由于柴胡皂苷具有环氧醚键，在提取过程中易受到酸性成分或酚类的影响而发生结构转换^[15]，宜在碱性环境下提取，本研究采用5%浓氨试液的甲醇水溶液作为提取介质，较好地保证提取过程中化合物的稳定性。在提取方式上，先后考虑到回流提取、浸渍过夜和超声提取等方式，结果回流提取2 h效果最好；其次是超声提取，浸渍效果较差，而超声提取率可以达到回流提取的90%，且时间短，操作简单易行，故以超声提取作为药材提取方法。

由于柴胡药材具有疏散退热、疏肝解郁等功效，已广泛被应用于中药成方制剂中，因此，加强柴胡药材的质量控制意义尤为重要。本研究通过考察钴[⁶⁰Co]辐照柴胡药材前后指标性活性成分含量的变化，得出辐照剂量不得高于5 kGy的结论，为今后柴胡药材的辐照灭菌提供参考。