木香顺气丸是由木香、醋香附、甘草、厚朴、苍术（炒）、砂仁、槟榔、陈皮、枳壳（炒）、青皮（炒）和生姜共11味药材制成的复方制剂，气香，味苦。临床用于湿浊中阻、脾胃不和所致的胸膈痞闷、脘腹胀痛、呕吐恶心和嗳气纳呆等症状。该药品成分复杂，含有多种化合物，现收载于中国药典2015年版一部^[1]，药典已对厚朴酚及和厚朴酚做定量检测要求，相关文献也对木香内酯类^[2-3]、甘草酸^[4]、辛弗林^[5]、橙皮苷^[6]等成分做了质量方法研究。而中药成分和药理作用都十分复杂，往往是多种成分联合作用在不同靶点发挥疗效，传统的单一成分研究已无法准确、真实、全面地对中成药进行综合质量评价^[7]。中药及其制剂的指纹图谱质量控制方法，目前已在国际上达成共识，此方法能真实、全面地评价药品质量，且有着良好的重现性和稳定性。在中药领域中，各种符合中药（天然药物）特色的指纹图谱控制技术体系正在研究和建立，如李家春等^[8]建立了桂枝茯苓胶囊HPLC指纹图谱，程红等^[9]对中药复方制剂仙灵骨葆胶囊HPLC指纹图谱做了研究，程宏英等^[10]建立菊花指纹图谱的同时测定其活性成分含量，潘伟东等^[11]对韩信草高效液相色谱指纹图谱做了研究，刘吉成等^[12]利用HPLC法建立了黑草药材指纹图谱，黄琪等^[13]对地锦草药材HPLC指纹图谱及识别模式做了研究，吴昭晖等^[14]对甘草药材指纹图谱做了深入探讨，朱林燕等^[15]对藏药二十一味寒水石丸的HPLC做了研究。本研究采用HPLC法对木香顺气丸进行指纹图谱研究，并对5个指标成分含量进行测定，旨在全面分析、评价木香顺气丸质量，为控制该药质量提高科学依据。

1 仪器和材料

Waters 2695型高效液相色谱仪（2489型紫外检测器，Empower 2色谱工作站；沃特世公司）；Agilent SB-C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，具有较大的二异丁基侧链基团；安捷伦公司）FP240型鼓风干燥箱（Binder公司）；AL104型电子天平（梅特勒公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司，功率250 W，超声频率40 kHz）；Milli-QAcademic超纯水系统（默克密理博公司）。

市售木香顺气丸15批，河南省康华药业股份有限公司4批，批号15091903（S1）、15102502（S2）、15111907（S3）、16031627（S4）；商丘市金马药业有限公司5批，批号15093021（S5）、15111508（S6）、15120923（S7）、16031615（S8）、16041526（S9）；河南百年康鑫医药有限公司6批，批号20150705（S10）、20151106（S11）、20151118（S12）、20151121（S13）、20160315（S14）、20160521（S15）。

对照品木香烃内酯（批号111524-201509，含量以99.0%计）、厚朴酚（批号110729-201513，含量以98.8%计）、和厚朴酚（批号110730-201614，含量以99.3%计）、去氢木香内酯（批号111525-201008，含量以99.6%计）、甘草酸铵（批号110731-201418，含量93.1%，1 mg甘草酸铵盐相当于甘草酸为0.979 5 mg），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，水为哇哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-乙腈（B）-0.2%磷酸水溶液（C）系统，梯度洗脱（0~5 min，10%A，10%B；5~20 min，10%A→20%A，10%B→20%B；20~40 min，20%A→50%A，20%B→10%B；40~60 min，50%A，10%B）；检测波长：225 nm；流速：1.0 mL·min^-1；柱温：35 ℃，进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品溶液

取木香烃内酯、去氢木香内酯、和厚朴酚、厚朴酚、甘草酸铵的对照品各适量，精密称定，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得每1 mL中分别含木香烃内酯33.6 μg，去氢木香内酯28.3 μg，和厚朴酚16.3 μg，厚朴酚15.8 μg和甘草酸铵33.6 μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

取本品药丸适量，研细，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL密塞，称量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。

2.3 指纹图谱方法学考察 2.3.1 精密度试验

取批号为20150705的木香顺气丸样品（S1号样品），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。以4号峰为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果共有峰相对保留时间的RSD均小于0.2%，相对峰面积的RSD均小于1.0%，6次采集到指纹图谱（以第1次进样色谱图为参照）的相似度均大于0.95，结果表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取批号为20150705的木香顺气丸样品（S1号样品），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取20 μL，依“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、10、12 h进样，记录色谱图。以4号峰为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果共有峰相对保留时间的RSD均小于0.3%，相对峰面积的RSD均小于1.1%，6个时间点采集到指纹图谱（以0 h进样色谱图为参照）的相似度均大于0.91，结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.3 重复性试验

取批号为20150705的木香顺气丸样品（S1号样品）6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件，进样测定，记录色谱图。以4号峰为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果共有峰相对保留时间的RSD均小于0.8%，相对峰面积的RSD均小于0.6%，6份样品指纹图谱（以第1份样色谱图为参照）的相似度均大于0.93，结果表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱研究 2.4.1 15批木香顺气丸HPLC指纹图谱的建立及相似度评价

取15批木香顺气丸（S1~S15号样品），依照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版）对色谱图进行分析，以S1号木香顺气丸样品的图谱为参考图谱，时间窗宽度设为0.5 min，采用多点校正后自动匹配指纹图谱，并以平均数法生成对照指纹图谱（见图 1），计算指纹图谱相似度。结果15批样品指纹图谱和对照指纹图谱相似度均大于0.9。计算结果见表 1。

2.4.2 指纹图谱中共有峰指认及相对峰面积计算

利用相似度评价系统软件处理，15批指纹图谱中共检测到8个共有峰。通过与混合对照品比对可以指认其中5个成分，分别是木香烃内酯、去氢木香内酯、和厚朴酚、厚朴酚和甘草酸，其保留时间分别为14.647、15.713、16.669、42.004和48.818 min。其中4号峰峰形较好，前后无杂质峰干扰，分离完全，出峰时间居中，因此选作参考峰，计算其他共有峰相对峰面积，计算结果见表 2。

2.5 木香顺气丸5个成分含量测定 2.5.1 色谱条件

同“2.1”项下色谱条件。

2.5.2 混合对照品溶液的制备

同“2.2.1”项下方法。

2.5.3 供试品溶液的制备

同“2.2.2”项下方法。

2.5.4 线性关系和定量限的考察

分别精密吸取混合对照品溶液2、10、20、30、50、60、80 μL注入高效液相色谱仪进行测定，记录色谱图。以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程见表 3。取混合对照品溶液，用甲醇逐步稀释，分别吸取20 μL注入色谱仪，取峰面积的信噪比为10（S/N=10）时的对照品浓度为定量限（LOQ），结果见表 3。

2.5.5 仪器精密度试验

取同一批样品[批号为20150705（S1号样品）]的供试品溶液，连续进样6针，记录色谱图；结果木香烃内酯、去氢木香内酯、和厚朴酚、厚朴酚和甘草酸峰面积的RSD分别为0.12%、0.25%、0.36%、0.42%、0.29%，说明仪器精密度良好。

2.5.6 稳定性试验

取同一批样品[批号为20150705（S1号样品）]的供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、18、24 h进样，记录色谱图；结果木香烃内酯、去氢木香内酯、和厚朴酚、厚朴酚和甘草酸峰面积的RSD分别为0.23%、0.15%、0.53%、0.33%、0.73%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.7 重复性试验

取同一批样品[批号为20150705（S1号样品）]，研细，取细粉约2.0 g，精密称定，按“2.2”项方法平行制备6份供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，以外标法求算各组分含量和RSD；结果木香烃内酯、去氢木香内酯、和厚朴酚、厚朴酚和甘草酸平均含量分别为5.01、2.18、10.76、4.48、3.66 mg·g^-1，RSD分别为0.42%、0.89%、0.59%、0.98%、0.46%，表明本方法重复性良好。

2.5.8 回收率试验

取已知含量木香顺气丸[批号为20150705（S1号样品）]，研细，取细粉6份，每份约1.0 g，精密称定，置50 mL量瓶中，分别精密加入木香烃内酯、去氢木香内酯、和厚朴酚、厚朴酚和甘草酸的对照品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，计算回收率；结果见表 4。

2.5.9 样品含量测定

取S1~S15号木香顺气丸样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，按外标法计算各组分含量，结果见表 5。

3 讨论 3.1 色谱条件的选择

木香顺气丸由11种药材制成，成分复杂，各化合物极性差别较大，紫外吸收各异，要满足同一条件尽可能多地分析未知化合物，首先要选择一个合适的色谱条件。为获得尽可能多的成分及有较好的分离效果，本研究分别考察了填料均为十八烷基硅烷键合硅胶的Sunfire C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent SB-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo AcclaimTM C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）及SHIMADZU VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）等几种型号和规格的色谱柱，其中Agilent SB-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱较其他色谱柱能获得较多色谱峰，分离度效果及峰形均较好，故选其作为研究用色谱柱。

利用紫外-可见光分光光度计对供试品溶液进行全波长扫描，发现在280 nm和225 nm处有较大吸收，与280 nm比较225 nm处所包含色谱信息较多，各色谱峰分离完全，所以本研究分析波长选择225 nm。本研究分别考察乙腈-磷酸盐水溶液和甲醇-磷酸盐水溶液流动相系统结果均达到理想分离效果，参考中华人民共和国药典厚朴酚含量检查流动相系统^[1]，经优化处理，各色谱峰分离度效果最好，检出峰数量较多，峰信号强度也比其他系统高，所以流动相选择甲醇-乙腈-0.2%磷酸水溶液系统。

3.2 系统聚类分析（CA）

利用SPSS 19.0版软件，以指纹图谱共有峰相对峰面积（见表 2）为变量，采用组间连接法，选用欧氏距离，设置聚类数为3，对15批木香顺气丸进行聚类分析，绘制聚类分析谱系图（见图 2）。从图可以看出，15批样品划分为3类，来自3个厂家生产的木香顺气丸各自聚成一类。结合表 3样品含量测定结果可以看出，不同厂家之间各成分含量存在较显著差异，尤其是去氢木香内酯差别较大，这可能与药材质量和处方工艺存在一定关系。

3.3 总结

目前，中药的质控方法很多，但多数局限于1种或几种成活性成分的检测，这对于成分较为单一的化学类药品简捷实用，但对于成分复杂，多成分联合发挥功效的传统中药来说，显得较为片面和单一，而指纹图谱分析法能全面系统地对药品进行“全身体检”，对药品进行综合评价，能为有效地控制药品质量提供强有力的技术支撑。

本研究建立了木香顺气丸HPLC指纹图谱法，共收集到3个厂家15批成药，液相色谱指纹图谱中共有8个共有峰，通过与混合对照品比较可以指认其中的5个有效成分，分别为木香烃内酯、去氢木香内酯、和厚朴酚、厚朴酚和甘草酸，为考察它们的质量，建立了五种成分的含量测定方法并测定15批样品中各成分百分含量，通过对结果进行聚类分析发现，不同厂家生产的木香顺气丸聚为一类。本研究建立了木香顺气丸HPLC指纹图谱法，方法快捷、简单，能系统快速地评价木香顺气丸的药品质量，为控制该药质量提高参考依据。